产品介绍

爱博泰克自主开发的T细胞活化磁珠产品，无需抗原递呈细胞，即可简单快捷地实现T细胞活化。该活化磁珠采用直径5 µm的惰性超顺磁珠作为固相载体，表面共价偶联功能级抗CD3和抗CD28抗体，可直接刺激T细胞。细胞培养过程中可使用重组IL-2刺激T细胞群扩增。活化或扩增后，磁珠可以通过磁力架轻松去除。

名称 货号
Human CD3/CD28 T Cell Activation Beads RK50023
Mouse CD3/CD28 T Cell Activation Beads RK50024

核心优势

双信号强力激活

磁珠表面同时提供CD3和CD28信号，无需额外添加抗原或饲养细胞。

高效扩增

磁珠形成的局部高浓度刺激，能高效诱导T细胞活化与增殖，适用于需要大量活化T细胞的研究场景。

质量稳定

共价偶联工艺确保抗体负载量的批间稳定性；减少实验中的变量因素，提升数据可靠性。

验证数据

Human CD3/CD28 T Cell Activation Beads收起

刺激72h后，
镜检结果：T细胞变大、形成明显集落。
流式结果：T细胞变大、不规则度上升，T细胞活化指标CD25，CD69明显上调。

Mouse CD3/CD28 T Cell Activation Beads收起

刺激72h后，
镜检结果：T细胞变大、形成明显集落。
流式结果：T细胞变大、不规则度上升，T细胞活化指标CD25，CD69明显上调。

操作步骤

  • 人T细胞激活和扩增
  • 小鼠T细胞激活和扩增
材料准备收起
  • 清洗 buffer: 含有2mM EDTA和2 % FBS的PBS或者含有2mM EDTA和0.5% BSA的PBS,需预先通过0.22 μm滤膜过滤除菌。
  • 细胞培养基：RPMI 1640添加2mM L-Glu、10%FBS、100 U/mL P/S。当需要扩增T细胞时，向培养基内额外加入30 U/mL重组人IL-2 (ABclonal#RP01039)。此外，商品化T细胞培养基同样适用，并且培养基内添加的生长因子可根据实验要求进行调整。
注意事项
  • 取用活化磁珠前彻底重悬磁珠（如涡旋>30秒，或置于旋转仪5分钟）， 吹打时避免产生气泡。
  • 进行流式检测前，使用磁力架去除磁珠（包括结合在细胞上的磁珠，可以通过轻柔吹打释放磁珠），此时细胞位于上清液中。收集上清液，进行下一步的流式检测。
样本制备收起
PBMCs的分离与准备
  • 人PBMCs分离准备：确保采集的抗凝全血不超过8小时，使用适当的抗凝剂（如柠檬酸钠或肝素）。
  • 密度梯度离心：从4℃冰箱取出Ficoll分离液，恢复至室温。向15ml离心管中加入全血体积的Ficoll分离液。
  • 血液稀释与加载：全血与PBS按1:1比例稀释，轻轻混匀。小心且缓慢地将稀释后的血液沿离心管壁加入，避免破坏Ficoll层与血液的界面。Ficoll分离液，PBS和血液的总体积不要超过离心管容量的2/3。
  • 离心：20℃，400 g，25 min，升速为1降速为0，将上述离心管小心转移到离心机中离心。
  • 收集PBMCs：离心后，血样会有明显分层：上层为血浆，中间为PBMC层（呈现为“白膜”），下层为红细胞和粒细胞。使用无菌吸管小心吸取中间的PBMC层，尽量避免吸到上层的血浆或下层的红细胞。
  • 洗涤：向含有PBMC的离心管中加入适量的PBS或培养基，充分混匀后再次离心，400g 5min，以去除残留的血浆、Ficoll和碎片。去除上清，重复洗涤步骤一次。
  • 细胞计数与调整密度：用适量的培养基（RPMI 1640，含2 mM L-谷氨酰胺，10%FBS）轻轻重悬PBMC，进行细胞计数，调整细胞浓度至1E7 cells/mL。
T细胞激活 (以分选后的人CD3+T细胞为例)收起
Ⅰ、清洗磁珠
  • 彻底重悬试管中的磁珠(如涡旋>30秒，或置于旋转仪5分钟)。
  • 吸取目标体积的磁珠至流式管中，加入同等体积的清洗 Buffer。若不足1mL，添加 1mL 的清洗 Buffer，涡旋5秒，或使用移液器吹打混匀，注意避免产生气泡(此处也可直接使用细胞培养基清洗)。
  • 将流式管置于磁力架上3分钟，弃上清。
  • 重复步骤2-3 ，本次使用细胞培养基对磁珠再次清洗。共清洗磁珠两次。
  • 使用细胞培养基重悬磁珠。例：吸取25 μL 磁珠进行清洗，清洗后用1mL 细胞培养基进行重悬。进行细胞活化时，每100 μL 磁珠悬液加至96孔板的一个孔中。
Ⅱ、人T细胞的活化(以96孔板为例)
  • 调整T 细胞浓度为1×10⁷ cells/mL，每孔中加入25 μL T细胞悬液，此时孔内含有2.5×10⁵个T 细胞，保持孔内体积为100 μL。
  • 向孔中加入100 μL清洗后重悬的磁珠，此时磁珠和细胞的比例为1:1。孔内液体总体积为200 μL，使用移液枪轻轻吹打混匀孔内的磁珠和细胞。
  • 将细胞与磁珠置于37℃，5% CO2 培养箱中孵育，根据实验需要决定细胞的培养时长。
  • 活化24小时至48小时内，收获活化的T细胞，用于下游实验分析。
Ⅲ、人T细胞的扩增
  • 按照以上步骤活化T 细胞，加入磁珠48小时后检测T细胞的活化情况。
  • 细胞状态良好时，对细胞进行轻柔吹打、传代(若细胞增殖较慢，可对细胞半量换液：小心吸弃100 μL 上清液，再向孔内添加100 μL 新鲜细胞培养基，轻柔吹打混匀细胞，继续培养1-2天后传代)，最后向孔内添加30 U/mL重组人IL-2 (ABclonal#RP01039)。
  • 细胞与磁珠置于37℃，5% CO2培养箱中培养，根据实验需要决定细胞的培养时长。
  • 每日或每隔两日查看细胞扩增情况，人T细胞扩增形态表现为镜下可见的增殖聚团，正常情况下T 细胞在活化后第4-12天表现出较快的增殖速度。当细胞皱缩或增殖速度明显放慢时，提示细胞可能耗竭。
  • 注：在细胞活化的48小时内不要处理细胞，也无需添加重组IL-2。2天后随时观察细胞状态，当培养基变黄或孔内细胞数量过多时换液或传代，并添加重组 IL-2。每次换液或传代后，应及时补充重组人IL-2至30 U/mL。 (推荐定期进行细胞计数，当细胞密度超过2.5×10⁶ cells/mL 时，轻柔吹打混匀，将细胞密度调整为0.5-1×10⁶ cells/mL)。
流式检测收起
  • 将细胞重悬于PBS中，调整细胞浓度至1×10⁷cells/mL。
  • 每管加入100 μL细胞悬液（约1×10⁶细胞），加入适量的荧光标记抗体（ABclonal#A27177， ABclonal#A26773，ABclonal#A25892ABclonal#A23345 ABclonal#A26218根据抗体说明书调整）。
  • 避光孵育15 - 30分钟，4℃。
  • 加入1 mL PBS洗涤细胞，400g离心5分钟，弃上清。
  • 重复洗涤一次，重悬细胞于200 μL PBS中，上机检测。
材料准备收起
  • 清洗buffer: 含有2 mM EDTA和2 % FBS的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS, 需预先通过0.22 μm滤膜过滤除菌。
  • 细胞培养基：RPMI 1640添加50 μM β-巯基乙醇、10% FBS、100 U/mL P/S。当需要扩增T细胞时，向培养基内额外加入30 U/mL重组人IL-2 (ABclonal#RP01039)或重组小鼠IL-2 (ABclonal#RP01384)。此外，商品化T细胞培养基同样适用，并且培养基内添加的生长因子可根据实验要求进行调整。
注意事项
  • 取用活化磁珠前彻底重悬磁珠（如涡旋>30秒，或置于旋转仪5分钟），吹打时避免产生气泡。
  • 进行流式检测前，使用磁力架去除磁珠（包括结合在细胞上的磁珠，可以通过轻柔吹打释放磁珠），此时细胞位于上清液中。收集上清液，进行下一步的流式检测。
样本制备收起
脾脏的分离与准备
  • 将小鼠处死后，从小鼠身上获取脾脏。
  • 在无菌条件下将脾脏进行剪碎、研磨、过滤、离心和重悬。
  • 取出脾脏置于装有20 mL 含1×P/S的 RPMI 1640培养基的10 cm平皿中；
  • 将脾脏置于75 μm 细胞过滤筛中，使用研磨棒将过滤筛中的脾脏研磨成单一的细胞(注意：边研磨边移动细胞过滤筛，并使用培养基冲洗细胞过滤筛，以便于细胞分散于培养基中);
  • 将含有细胞的培养基移入50 mL 离心管中，并使用新的培养基冲洗平皿，同样将培养基移入离心管中，培养基总量不超过30 mL;
  • 脾脏裂红处理：室温离心 400 g×5min，去上清，留细胞，加入13 mL常温的红细胞裂解液进行红细胞裂解，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min， 加入基础培养基37 mL，混匀，终止红细胞裂解；
  • 室温离心400 g×5min ，去上清，留细胞，加入40 mL 常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗；
  • 室温离心400g×5min，去上清，留细胞，加入20 mL常温放置的 20% FBS培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，并将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞；
  • 室温离心400 gx5min，弃去上清；
  • 加入20 mL完全培养基(RPMI 1640+10%FBS+1×P/S)重悬细胞，准备细胞计数。
T细胞激活(以分选后的小鼠 CD3+T细胞为例)收起
Ⅰ、清洗磁珠
  • 彻底重悬试管中的磁珠(如涡旋>30秒，或置于旋转仪5分钟)。
  • 吸取目标体积的磁珠至流式管中，加入同等体积的清洗 Buffer 。若不足1 mL，添加1 mL的清洗Buffer ，涡旋5秒，或使用移液器吹打混匀，注意避免产生气泡(此处也可直接使用细胞培养基清洗)。
  • 将流式管置于磁力架上3分钟，弃上清。
  • 重复步骤2-3，本次使用细胞培养基对磁珠再次清洗。共清洗磁珠两次。
  • 使用细胞培养基重悬磁珠。例：吸取25 μL磁珠进行清洗，清洗后用1 mL 细胞培养基进行重悬。进行细胞活化时，每100 μL 磁珠悬液加至96孔板的一个孔中。
Ⅱ、小鼠T细胞的活化(以96孔板为例)
  • 调整T细胞浓度为1×10⁷ cells/mL，每孔中加入25 μL T细胞悬液，此时孔内含有2.5×10⁵个T细胞，保持孔内体积为100 μL。
  • 向孔中加入100 μL 清洗后重悬的磁珠，此时磁珠和细胞的比例为1:1 ，孔内液体总体积为200 μL，使用移液枪轻轻吹打混匀孔内的磁珠和细胞。
  • 将细胞与磁珠置于37℃ ，5% CO2 培养箱中孵育，根据实验需要决定细胞的培养时长。
  • 活化24小时至48小时内，收获活化的T 细胞，用于下游实验分析。
Ⅲ、小鼠T细胞的扩增
  • 按照以上步骤活化T 细胞，加入磁珠48小时后检测T细胞的活化情况。
  • 细胞状态良好时，对细胞进行轻柔吹打、传代(若细胞增殖较慢，可对细胞半量换液：小心吸弃100 μL上清液，再向孔内添加100 μL新鲜细胞培养基，轻柔吹打混匀细胞，继续培养1-2天后传代)，最后向孔内添加30 U/mL的重组人IL-2。
  • 细胞与磁珠置于37℃，5% CO2培养箱中培养，根据实验需要决定细胞的培养时长。
  • 每日或每隔两日查看细胞扩增情况，小鼠T 细胞扩增形态表现为镜下可见的增殖聚团，正常情况下T 细胞在活化后第4-12天表现出较快的增殖速度。当细胞皱缩或增殖速度明显放慢时，提示细胞可能耗竭。
  • 注意：在细胞活化的48小时内不要处理细胞，也无需添加重组IL-2。2天后随时观察细胞状态，当培养基变黄或孔内细胞数量过多时换液或传代，并添加重组 IL-2。每次换液或传代后，应及时补充重组人或小鼠IL-2至30 U/mL。(推荐定期进行细胞计数，当细胞密度超过2.5×10⁶ cells/mL时，轻柔吹打混匀，将细胞密度调整为0.5-1×10⁶ cells/mL)。
流式检测收起
  • 将细胞重悬于PBS中，调整细胞浓度至1×10⁷/mL。
  • 每管加入100 μL细胞悬液（约1×10⁶细胞），加入适量的荧光标记抗体（ABclonal#A28704，ABclonal#A23808，ABclonal#A26449 ABclonal#A26743 ABclonal#A25933根据抗体说明书调整）。
  • 避光孵育15 - 30分钟，4℃。
  • 加入1 mL PBS洗涤细胞，400g离心5分钟，弃上清。
  • 重复洗涤一次，重悬细胞于200 μL PBS中，上机检测。