铁死亡检测方法
| 检测方法 | 实验描述 |
|---|---|
| 细胞形态观察 | 利用透射电镜直接对细胞形态进行观察，细胞发生铁死亡时线粒体变小以及线粒体膜密度较大。 |
| 线粒体形态观察 | 向细胞内转染LifeAct-GFP荧光蛋白，一定时间后通过有丝分裂追踪器观察线粒体的形态。 |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂盒检测其细胞活性。 |
| 细胞内铁水平检测 | 可使用PGSK探针检测，通过流式细胞术或共聚焦显微镜监测活细胞内铁含量的细胞膜透性染料，在铁死亡的细胞中，PGSK的绿色荧光会减弱。 |
| 线粒体膜电位检测 | 使用TMRE荧光染料检测，TMRE能够特异性标记有活性的线粒体。当线粒体膜电位降低时，荧光减弱。 |
| 脂质过氧化检测 | 脂质活性氧的积累和铁死亡中谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低，导致铁引起的脂质过氧化的增加。脂质氧化降解，导致细胞膜受损。可使用 C11 BODIPY 581/591脂质探针，通过比率计荧光检测法检测铁死亡中脂质过氧化的增加情况。 |
| qPCR/Western Blot检测 | 检测细胞内与铁死亡相关的因子变化，例如Cox2, ACSL4和NOX1在铁死亡细胞中表达上调; GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain在铁死亡细胞中表达下调。 |
自噬检测方法
| 检测方法 | 实验描述 |
|---|---|
| 电镜形态学观察 | 电镜下，发生自噬的细胞可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性，其周围有空泡状双层膜样结构，或双层膜环绕线粒体形成自噬体，也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。 |
| Western blot 检测核心靶标 | 检测LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化以评估自噬的强弱。 |
| p62作为自噬的重要受体，主要依赖于自噬途径进行降解。 | |
| 荧光蛋白标记 | 无自噬时，GFP-LC3在胞浆中弥散分布；自噬形成时，GFP-LC3聚集于自噬体膜上。在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量。 |
| 溶酶体内的酸性环境导致GFP荧光信号淬灭，而红色荧光蛋白对酸性环境具有很好的耐受性，可以构建RFP-GFP-LC3串联体。自噬形成时，自噬体呈黄色标记（绿色和红色图像重合），自噬溶酶体呈红色标记。 | |
| GFP-LC3和RFP-LC3 ΔG分别充当自噬底物和内对照。GFP-LC3相对于RFP-LC3 ΔG的比值与自噬强弱呈负相关。 | |
| Keima是一种荧光蛋白，在中性和酸性条件下有不同的激发峰这一特性使我们能够监测Keima从细胞质到溶酶体的递送。Keima适用于监测大量（非选择性）自噬和小自噬。 |
细胞凋亡检测方法
| 检测方法 | 实验描述 |
|---|---|
| 电镜形态学观察 | 利用透射电镜对细胞形态进行观察，细胞出现染色质凝缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等现象。 |
| Annexin V/PI流式检测 | 细胞发生早期凋亡时，细胞膜上的PS外翻。AnnexinV是一种蛋白，可与PS进行结合。当细胞发生凋亡时，可利用连接荧光染料的Annexin V与外翻的PS结合，通过检测荧光基团的信号判定凋亡发生情况。 |
| 线粒体跨膜电位检测 | 正常细胞线粒体膜电位较高，JC-1可聚集发出红色荧光；当细胞发生凋亡时，线粒体膜电位降低，JC-1无法聚集，便以绿色单体存在。 |
| DNA 片段化检测 | 细胞凋亡晚期，DNA片段化，断裂的DNA暴露出的3’-OH可以被末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化，与荧光素标记的dUTP结合。 |
| Western blot 检测核心靶标 | 抗凋亡 Bcl-2家族蛋白裂解，检测其表达量变化。 |
| 细胞色素c 释放，检测其表达量变化。 | |
| 分析前体和活化Caspase 的表达量。 |
