流式细胞术常见实验流程

样本制备

流式细胞术检测的样本为单细胞悬液，因此，悬浮细胞或外周血细胞在流式分析时简便、快捷。对于贴壁细胞及实体组织在进行流式染色前，需要制成单细胞悬液，常用方法包括酶消化或机械性的组织解离。以下提供常见样本处理方法：

悬浮细胞
  • 1用移液枪吹打混匀；
  • 2收集于15 mL或50 mL离心管中（根据细胞量选用）。
贴壁细胞
  • 1倒掉培养基，用10 mL 1×PBS，pH 7.4清洗后，再用3 mL 0.05% Trypsin-EDTA 溶液室温下消化3 min，显微镜下观察有大量细胞脱落；
  • 2用15 mL培养基终止反应，接着用移液枪反复吹打冲洗贴壁细胞，收集于15 mL或50 mL离心管中（根据细胞量选用）。
淋巴组织

脾脏组织

  • 1取出脾脏并置于装有20 mL含1×P/S的RPMI1640培养基的10 cm平皿中；
  • 2将脾脏置于75μm细胞过滤筛中，使用研磨棒将过滤筛中的脾脏研磨成单一的细胞（注意：边研磨边移动细胞过滤筛，并使用培养基冲洗细胞过滤筛，以便于细胞分散于培养基中）；
  • 3将含有细胞的培养基移入50 mL离心管中，并使用新的培养基冲洗平皿，同样将培养基移入离心管中，培养基总量不超过30 mL；
  • 4裂红处理：室温离心400 g x 5 min，去上清，留细胞，加入13 mL常温的红细胞裂解液进行红细胞裂解，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1 min，加入基础培养基37 mL，混匀，终止红细胞裂解；
  • 5室温离心400 g x 5 min ，去上清，留细胞，加入40 mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗；
  • 6室温离心400 g x 5 min，去上清，留细胞，加入20 mL常温放置的20% FBS培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，并将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞；
  • 7室温离心400 g x 5 min，弃去上清；
  • 8加入20 mL完全培养基（RPMI1640 + 10% FBS + 1×P/S）重悬细胞，准备细胞计数。

胸腺组织

  • 1取出胸腺并浸泡于装有10 mL含1%双抗溶液的无血清培养基的10 cm培养皿中；
  • 2将胸腺置于200目筛网中，用组织研磨棒轻轻研磨至没有明显块状物；
  • 3用15 mL PBS冲洗筛网，并将冲洗液收集于15 mL离心管，300 g离心5 min，弃上清；
  • 4用完全培养基重悬胸腺细胞，用200目筛网过滤悬液，300 g离心5 min，弃上清，用完全培养基重悬胸腺细胞并调整细胞浓度至1×107/mL。

染色流程
细胞表面染色
  • 1细胞计数：将细胞收集于50 mL离心管中并计数；500 g离心4 min，去上清；
  • 2制备单细胞悬液：将收集的细胞用 1 mL 0.5% BSA/PBS溶液重悬，400 g离心3 min，去上清，重复2次；用 0.5% BSA/PBS溶液重悬细胞，分配到96孔板中，每孔50 μL细胞悬液；
  • 3封闭（可选）：依据染色方案及细胞种属，使用10%的山羊血清/10%的小鼠血清/商品化的封闭剂，在室温下孵育30-60分钟，封闭Fc介导的非特异性结合；
  • 4一抗孵育：每孔加入一抗稀释液50 μL；振荡，室温反应20 min；
  • 5洗涤：400 g离心5 min，去上清；
  • 6二抗孵育：若一抗未标记荧光，则需加入相应种属的荧光二抗稀释液，100 μL/孔，重悬避光振荡，室温反应20 min；直标荧光抗体直接跳转到步骤9；
  • 7以 400 g 的速度离心 5 分钟，去上清；
  • 8固定（可选）：若非染色后立即上机检测，则使用100 μL 4%多聚甲醛重悬细胞，室温孵育10分钟之后，使用0.5% BSA/PBS洗涤2次；
  • 9洗涤：加入200 μL 0.5% BSA/PBS重悬，400 g离心5 min，去上清，重复两遍；
  • 10用200 μL 0.5% BSA/PBS重悬细胞，上机分析。
细胞胞内染色

甲醛/皂素法（胞浆蛋白）

  • 1细胞制备：收集待检测细胞样本，计数并测活率，然后用 1 mL 0.5% BSA/PBS溶液重悬洗涤2次，400 g离心3 min弃上清；
  • 2死活染色：使用L/D染料稀释液，室温避光染色15 min，离心弃上清，使用1 mL 0.5% BSA/PBS洗涤2次；
  • 3细胞固定：使用4%多聚甲醛固定液重悬细胞，旋转避光孵育固定15 min，再使用0.5% BSA/PBS洗涤1次；
  • 4细胞破膜：使用含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS配制破膜液，使用该破膜液重悬细胞，避光孵育1 h后，离心弃上清；（该步骤后所有Buffer应均含有0.1%皂素，因为皂素破膜是可逆的）；
  • 5一抗孵育：用含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS溶液重悬细胞，均分到96孔板中，50 μL/孔（每孔细胞量≤1E6），然后加入一抗稀释液（用含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS溶液稀释），50 μL/孔，混匀；将96孔板置于振荡仪上，室温避光孵育30 min；
  • 6一抗洗涤：孵育结束后，400 g离心5 min弃上清，每孔用200 μL 含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS重悬洗涤，400 g离心5 min弃上清；
  • 7二抗孵育：若一抗未标记荧光，则需加入相应种属的荧光二抗稀释液（用含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS溶液稀释），100 μL/孔 ，避光振荡，室温孵育30 min；若一抗已标记荧光，则重复步骤6后跳转到步骤9；
  • 8二抗洗涤：孵育结束后，400 g离心5 min弃上清，每孔用200 μL 含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS重悬洗涤2次，400 g离心5 min弃上清；
  • 9重悬上机：使用100-200 μL 含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS重悬细胞，上机分析。

甲醛/Triton法（核蛋白）

  • 1细胞制备：收集待检测细胞样本，计数并测活率，然后用 1mL 0.5% BSA/PBS溶液重悬洗涤2次，400 g离心3 min弃上清；
  • 2死活染色：使用L/D染料稀释液，室温避光染色15 min，离心弃上清，使用1mL 0.5% BSA/PBS洗涤2次；
  • 3细胞固定：使用4%多聚甲醛固定液重悬细胞，旋转避光孵育固定15 min，再使用0.5% BSA/PBS洗涤1次；
  • 4细胞破膜和封闭：使用Triton X-100破膜液重悬细胞，旋转避光孵育破膜15 min，离心弃上清，再使用Fc受体封闭液重悬，孵育1 h后，离心弃上清；
  • 5一抗孵育：用0.5% BSA/PBS溶液重悬细胞，均分到96孔板中，50 μL/孔（每孔细胞量≤1E6），然后加入一抗稀释液（0.5% BSA/PBS溶液稀释），50 μL/孔，混匀；将96孔板置于振荡仪上，室温避光孵育30 min；
  • 6一抗洗涤：孵育结束后，400 g离心5 min弃上清，每孔用200 μL 0.5% BSA/PBS重悬洗涤，400 g离心5 min弃上清；
  • 7二抗孵育：若一抗未标记荧光，则需加入相应种属的荧光二抗稀释液，100 μL/孔 ，避光振荡，室温孵育30 min；若一抗已标记荧光，则重复步骤6后跳转到步骤9；
  • 8二抗洗涤：孵育结束后，400 g离心5 min弃上清，每孔用200 μL 0.5% BSA/PBS重悬洗涤2次，400 g离心5 min弃上清；
  • 9重悬上机：使用100-200 μL 0.5% BSA/PBS重悬细胞，上机分析。

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