流式细胞术常见实验流程- ABclonal

流式细胞术常见实验流程

样本制备

流式细胞术检测的样本为单细胞悬液，因此，悬浮细胞或外周血细胞在流式分析时简便、快捷。对于贴壁细胞及实体组织在进行流式染色前，需要制成单细胞悬液，常用方法包括酶消化或机械性的组织解离。以下提供常见样本处理方法：

悬浮细胞

1用移液枪吹打混匀；
2计数，调整至细胞密度为5-10×10⁶个细胞/mL。

贴壁细胞

1倒掉培养基，用1×PBS清洗后，立即使用TrypLETM Express酶溶液消化，显微镜下观察约80%~90%的细胞变圆、开始脱离底面（轻拍培养瓶可见细胞成片滑落）；
2加入等体积培养基终止反应，用移液枪吹打分散成单细胞悬液，400 g离心5 min，弃上清，用培养基重悬，计数，调整至细胞密度为5-10×10⁶个细胞/mL。

淋巴组织

小鼠脾脏组织

1将取出的脾脏剪成小块；
2将组织碎片置于安装在10 cm平皿上的细胞过滤筛中；
3用研磨棒将脾脏组织经筛网研磨过滤；
4用适量基础培养基冲洗筛网，将含有细胞的培养基移入50 mL离心管中，收集细胞；
5裂红处理：细胞悬液400 g离心5 min，去上清，根据对应红细胞裂解液产品推荐方法对样本进行处理；
6洗涤：400 g离心5 min，去上清，基础培养基洗涤1次；
7400 g离心5 min，去上清，加入完全培养基重悬细胞经细胞过滤筛再次过滤去除结团细胞，计数，调整至细胞密度为5-10×10⁶个细胞/mL。

小鼠胸腺组织

1将取出的胸腺剪成小块；
2将组织碎片置于安装在10 cm平皿上的细胞过滤筛中；
3用研磨棒将胸腺组织经筛网研磨过滤；
4用适量含1%双抗溶液的无血清培养基冲洗筛网，将含有细胞的培养基移入50 mL离心管中，收集细胞；
5400 g离心5 min，去上清，加入完全培养基重悬细胞经细胞过滤筛再次过滤去除结团细胞，计数，调整至细胞密度为5-10×10⁶个细胞/mL。

小鼠骨髓组织

1用剪刀轻轻将股骨及胫骨上下两端剪掉，露出骨腔；
2用5 mL注射器吸取含1%双抗溶液的无血清培养基，注入骨腔内稍有力度的冲洗至装有适量培养基的10 cm培养皿中，直至骨腔变白、无肉眼可见的红色骨髓残留；
3将含有细胞的培养基移入50 mL离心管中，收集细胞；
4裂红处理：细胞悬液400 g离心5 min，去上清，根据对应红细胞裂解液产品推荐方法对样本进行处理；
5洗涤：400 g离心5 min，去上清，基础培养基洗涤1次；
6400 g离心5 min，去上清，加入完全培养基重悬细胞经细胞过滤筛再次过滤去除结团细胞，计数，调整至细胞密度为5-10×10⁶个细胞/mL。

染色流程

试剂

1Human FcR Blocking Antibody (A29167)
2Rat anti-Mouse CD16/CD32 mAb (Mouse Fc Block) (A29013)
3可固定死活染料试剂盒（NIR Fluorescence） (RK50037)
4可固定死活染料试剂盒（Green Fluorescence） (RK50038)
57-AAD (7-氨基放线菌素D) (RM02985)
6即用型7-AAD (RK50041)
7DAPI 染色液 (RM02978)
8流式胞内固定破膜试剂盒 (RK50040)
9Foxp3/转录因子流式固定破膜试剂盒 (RK50039)

细胞表面染色

选用胺基死活细胞鉴定染料

1制备单细胞悬液：将细胞进行收集，计数并测活率、离心，用流式染色缓冲液洗涤重悬；
2封闭（可选）：依据染色方案及细胞种属，使用适量商品化封闭剂（Human A29167/Mouse A29013）/山羊血清/小鼠血清，商品化的封闭剂在2-8℃下避光孵育10 min，山羊血清/小鼠血清在2-8℃下避光孵育30 min，封闭Fc介导的非特异性结合；
3死活染色（可选）：加入适量胺基死活细胞鉴定染料（RK50037/RK50038）染色，室温避光孵育20-30 min（具体用量可参考说明书），400 g离心5 min，去上清，洗涤1-2次；
4抗体孵育：加入推荐量的流式标记抗体，振荡，2-8℃避光孵育20-30 min；
5洗涤：400 g离心5 min，去上清，洗涤1-2次；
6用适量流式染色缓冲液重悬细胞，上机分析。

选用核酸死活细胞鉴定染料

1制备单细胞悬液：将细胞进行收集，计数并测活率、离心，用流式染色缓冲液洗涤重悬；
2封闭（可选）：依据染色方案及细胞种属，使用适量商品化封闭剂（Human A29167/Mouse A29013）/山羊血清/小鼠血清，商品化的封闭剂在2-8℃下避光孵育10 min，山羊血清/小鼠血清在2-8℃下避光孵育30 min，封闭Fc介导的非特异性结合；
3抗体孵育：加入推荐量的流式标记抗体，振荡，2-8℃避光孵育20-30 min；
4洗涤：400 g离心5 min，去上清，洗涤1-2次；
5死活染色（可选）：加入适量核酸死活细胞鉴定染料（RM02985/RK50041/RM02978）染色，2-8℃避光孵育（具体用法用量可参考说明书）；
6无需洗涤，上机分析。

细胞胞内染色

1制备单细胞悬液：将细胞进行收集，计数并测活率、离心，用流式染色缓冲液洗涤重悬；
2死活染色（可选）：加入适量胺基死活细胞鉴定染料（RK50037/RK50038）染色，室温避光孵育20-30 min（具体用量可参考说明书），孵育结束后，400 g离心5 min去上清，洗涤1-2次；
3细胞表面染色（可选）：参考上述细胞表面染色实验流程；
4固定：使用适量商品化固定破膜剂（胞内靶标：RK50040/核内靶标：RK50039）中的固定液重悬细胞，旋转避光孵育固定（具体用法用量参考说明书），或使用适量4%多聚甲醛固定液重悬细胞，旋转避光孵育固定15 min，离心，去上清，洗涤一次（注意：此步骤开始核内靶标商品化固定破膜剂配有专用染色缓冲液）；
5破膜：使用适量商品化固定破膜剂中破膜液/Triton X-100破膜液/含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS配制破膜液重悬细胞，避光孵育（商品化破膜液孵育时间参考说明书，Triton X-100破膜液孵育15 min，含有0.1%皂素的0.5% BSA/PBS配制破膜液孵育1 h），孵育结束，离心弃上清；（该步骤后甲醛/皂素法所有Buffer应均含有0.1%皂素，因为皂素破膜是可逆的）；
6封闭（可选）：依据染色方案及细胞种属，使用适量商品化封闭剂（Human A29167/Mouse A29013）/山羊血清/小鼠血清，商品化的封闭剂在2-8℃下避光孵育10 min，山羊血清/小鼠血清在2-8℃下避光孵育30 min，封闭Fc介导的非特异性结合；
7胞内抗体孵育：用染色缓冲液重悬细胞，加入推荐量的胞内流式标记抗体，混匀，2-8℃避光孵育20-30 min；
8洗涤：孵育结束后，400 g离心5 min弃上清，洗涤1-2次；
9用适量流式染色缓冲液重悬细胞，上机分析。