无染色或染色弱
| 原因分析 | 解决方案 |
| 蛋白的表达水平过低 | 对于表达水平过低的靶点，染色时需搭配强荧光染料。也可尝试一抗、二抗搭配进行间接染色，以提高检测灵敏度。 |
| 样本中靶蛋白表达情况不明 | 可采用明确表达靶蛋白的样本作为阳性对照，靶蛋白的无表达或者KO细胞作为阴性对照。 |
| 分泌性因子检测未使用阻断剂 | 细胞因子、趋化因子等分泌性蛋白可通过使用莫能菌素、布雷菲尔德菌素A或二者联用进行阻断，使因子保留在胞内。 |
| 固定、破膜液选择不当 | 当对胞浆和核内靶点进行染色时，应使用合适的固定、破膜液，以确保更好的检测胞浆和核内蛋白。 |
| 抗体保存不当 | 严格按照说明书推荐条件进行保存。 |
| 荧光染料淬灭 | 荧光直标抗体及荧光直标抗体染色后的样本需注意避光保存。 |
| 抗体使用浓度不当 | 通过抗体滴定测定，摸索抗体的最佳工作浓度。 |
| 孵育时间和温度不当 | 抗体孵育时间、温度建议优先参考抗体说明书上推荐的条件，如果结果不理想，可以进行适当梯度摸索。 |
| 一抗二抗不匹配 | 间标流式染色时，需确保荧光二抗与一抗种属来源正确匹配。 |
| 使用的滤片不正确 | 检查所用荧光染料的激发波长与发射波长，确保使用正确的激光和滤片进行数据采集。 |
| 数据过度补偿 | 利用单染对照和荧光减一（FMO）对照为每次实验设定补偿。 |
| 细胞群的设门不正确 | 确保对细胞群的正确设门。 |
高背景或非特异性染色
| 原因分析 | 解决方案 |
| 自发荧光较高 | 细胞自发荧光取决于细胞类型，也可能受到细胞制备方法的影响。使用相同刺激条件，但不用任何试剂染色的样本作为细胞自发荧光的对照。 |
| 存在死细胞 | 在进行活细胞表面染色时，使用活细胞鉴定染料（如 PI 或 7-AAD）对死细胞设门。但对固定细胞完成染色时，使用可固定的活细胞鉴定染料，该染料能经受固定处理，可在胞内染色时结合使用。 |
| FcR阻断不充分 | 使用FcR阻断试剂或Fab片段来规避FcR的影响。 |
| 抗体浓度过高 | 采用说明书推荐的抗体用量，并根据实验情况进行抗体用量滴定。 |
| 抗体孵育时间过长 | 抗体孵育时间可参考厂家推荐条件，并根据实验进行适当梯度摸索。 |
| 洗涤不充分 | 增加染色后的洗涤次数。 |
| 补偿调节不足 | 利用单染对照和荧光减一（FMO）对照为每次实验设定补偿。 |
其他异常染色
| 异常染色 | 原因分析 | 解决方案 |
| 假阳性 | 分析中含细胞黏连体或死细胞 | 采用单细胞群设门，并使用活性染料，排除黏连体和死细胞。 |
| 抗体特异性差 | 更换特异性好的抗体。 | |
| 同型对照抗体染色信号高于检测抗体 | 同型对照抗体使用浓度不对 | 同型对照抗体使用终浓度与检测抗体一致。 |
| 同型对照抗体来自于不同厂家 | 使用与检测抗体同一厂家生产的同型对照抗体 |
