产品中心 / 产品类型 / 分子生物学产品 / qPCR / 一步法RT-qPCR
| 组分 | 50 RXN (20 μL 体系/RXN) | 250 RXN (20 μL 体系/RXN) |
| 2X One Step RT-qPCR Probe Buffer IV | 500 μL | 1.25 mL X 2 |
| One Step Probe Enzyme Mix IV | 100 μL | 500 μL |
| 50X ROX Dye I | 20 μL | 100 μL |
| 50X ROX Dye II | 20 μL | 100 μL |
| Nuclease-free ddH2O | 500 μL | 1.25 mL X 2 |
| log | 2 | 1 | 0 | -1 | -2 | E（%） | R2 |
| ABclonal | 21.061922 | 24.343271 | 27.594267 | 31.290552 | 35.469372 | 90.38 | 0.997 |
| Vendor V | 23.228533 | 26.459255 | 29.930073 | 33.623936 | 37.719734 | 89.08 | 0.9979 |
| Vendor T | 23.345409 | 26.746599 | 30.082512 | 33.610199 | 37.866066 | 89.89 | 0.9975 |
以小鼠RNA为模板(100 ng/μl为起始浓度)，5‘端TAMRA荧光标记探针，10倍梯度稀释，能很好的检测出目的基因，同其他厂家产品相比具有较高的检测灵敏性。
以小鼠RNA为模板(100 ng/μl为起始浓度)，10倍梯度稀释，用四重扩展体系进行扩增，结果显示，ABScript III One Step RT-qPCR Probe Kit with UDG V5能兼容四重扩增体系
| log | -2 | -3 | -4 | -5 | -6 | -7 | -8 | E（%） | R2 |
| FAM-ORF1ab | 23.43 | 26.42 | 29.91 | 33.68 | 37.26 | 40.84 | Undetermined | 92.25 | 0.999 |
| VIC-N | 21.89 | 24.97 | 28.42 | 32.09 | 36.06 | 40.76 | Undetermined | 84.75 | 0.9949 |
以新冠样本为模板，10倍梯度稀释，结果显示，ABScript III One Step RT-qPCR Probe Kit with UDG V5能对新冠病毒的ORF1基因和N基因进行很好的检出。
ABScript III One Step RT-qPCR Probe Kit with UDG V5 有着优异的稳定性，在37℃储存7 d，或者反复冻融50 次，试剂性能不会受到明显影响（红色曲线为对照）
Q1：熔解曲线出现多峰
引物设计不够优化：根据引物设计原则重新设计引物。
引物浓度太高：适当降低引物浓度。
Q2：扩增曲线形状异常
扩增曲线不光滑：信号太弱，提高模板浓度并重复实验。
个别扩增曲线骤降：反应管内有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。处理样本时要注意离心，加样过程中尽量避免吸打出气泡。
扩增曲线上飘：仪器测试默认基线设置为3至15个循环荧光值的标准差，可根据实际扩增情况进行相应基线调整。
Q3：反应结束无扩增曲线出现
反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。
确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
模板浓度太低：减少稀释程度并重复实验。
模板降解：重新制备模板，重复实验。
预变性时间不足：本产品采用热启动的Taq酶，请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。
Q4：Ct值出现太晚
扩增效率极低：优化反应条件，重新设计引物。
模板浓度太低：减少稀释程度，重复实验。
模板降解：重新制备模板，重复实验。
PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为70~200 bp范围内。
反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，加大模板稀释倍数或者重新制备新的模板。
预变性时间不足：本产品采用热启动的Taq酶，请确保按照反应程序设置的3 min预变性时间进行实际操作。
Q5：阴性对照(NTC)出现明显扩增
反应体系或者水被污染：更换新的Buffer或者水进行重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
引物二聚体的出现：一般在35个循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
Q6：重复性差
加样体积不准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体系，增加组分加入体积。
定量PCR仪孔间温度不一致：定期校准仪器。
模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。
阈值设置：对于不同板间的重复试验，请确保两次试验仪器阈值设置保持一致。
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