N6-methyladenosine / m6A Rabbit pAb (A17924)

4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。

• (1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
• (2) 固定液：4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制）
• (3) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
• (4) 通透剂：0.3% Triton X-100（TBS缓冲液配制）
• (5) 二抗（可选）：
  使用兔源一抗可选二抗：
  Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
  Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
  使用鼠源一抗可选二抗
  Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
  Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
• (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制）
• (7) 去离子水（dH₂O）、抗荧光衰减封片剂。

• (1) 弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；
• (2) 细胞固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；
• (3) 固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；
• (4) 通透：对于细胞骨架，细胞器或细胞核定位蛋白，可增加通透步骤，使用冰甲醇冰上处理5-10min(可选)；

• （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
• （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜；
• （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
• （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
• （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：TBS缓冲液体积比1:1000，避光，室温，孵育30分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
• （6）细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞爬片可取出，盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后，于荧光显微镜下观察并采集图像。

微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。

• (1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
• (2) 修复液（可选）：
  pH6.0 0.01M柠檬酸修复液（1L）：C₆H₈O₇•H₂O 0.4g；NaC₆H₅O₇•2H₂O 3g；pH6.0；
  pH9.0 0.01M Tris-EDTA修复液（1L）：C₄H₁₁NO₃ 1.21g；C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈•2H₂O 0.37g；pH9.0。
• (3) 封闭液：5%空白山羊血清
• (4) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
• (5) 二抗：
  使用兔源一抗可选二抗：
  Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS074；
  Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)# AS073；
  使用鼠源一抗可选二抗：
  Alexa Fluor 594-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS077；
  Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)# AS076；
• (6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制）
• (7) 去离子水（dH₂O）、抗荧光衰减封片剂。

• (1) 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
• (2) 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、95%乙醇的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。

• （1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
  注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开微波炉门；修复完成后不可快速冷却；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
• （2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时3分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液洗涤3次，每次1min。
  注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。

• （1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
• （2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于4℃孵育过夜；
• （3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
• （4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
• （5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:1000，避光，室温，孵育30分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
• （6）滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像。