1. 蛋白复溶注意事项

蛋白复溶注意事项蛋白复溶：蛋白冻干粉主要分布在西林瓶底部边缘一圈，如果是运输过程造成冻干粉脱落散落在瓶子其他位置，建议复溶之前先离心。目前没有针对西林瓶专用离心机，可将瓶放置在50mL离心管中，用脱脂棉固定，瞬时离心之后再复溶，用移液器吸取适量无菌水（建议按照说明书推荐浓度进行复溶，具体也可根据客户实际实验需要，但浓度不宜过高，会导致盐离子浓度过高影响蛋白的溶解效率和稳定性），直接伸入西林瓶底部，沿西林瓶底部画一个圈，边转边打出液体，液体全部打出后不要更换枪头小心吹吸几下，使均匀分布在瓶底的蛋白冻干粉溶解，然后将复溶后的液体吸出。注意事项：西林瓶胶塞可以打开，打开前瞬时离心，如果没有无菌和无热源要求可在外面打开，如果有无菌无热源要求可在超净台打开，如果蛋白产品规格比较小(10ug)，溶解时加入水体积小，不建议使用注射器直接注水复溶，会导致针头中蛋白损失严重。

2. 蛋白表达系统介绍

蛋白表达系统介绍1 定义蛋白表达系统指宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因顺利的实现在宿主中表达。蛋白表达体系通常由以下几部分组成：（1）宿主：用来表达的生物体，可以为细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种宿主生物本身的特性多种多样，因此采用的表达体系也不相同。（2）载体：载体的选择需要根据宿主而定，根据宿主不同，分为原核（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中还有外源基因片段，外源基因通过载体介导，可以在宿主中表达。（3）辅助成分：有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分，比如：昆虫-杆状病毒表达系统中的杆状病毒。2 不同蛋白表达系统的介绍类型大肠杆菌酵母细胞杆状病毒-昆虫细胞哺乳动物细胞表达系统原核真核真核真核优势经济；快速；高产量；应用广泛经济；快速；高产量；部分翻译后修饰基因容量大；可溶蛋白；适合毒性蛋白；类似哺乳动物系统翻译后修饰可溶蛋白；耕地内毒素；更好的活性；更好的翻译后修饰；可瞬时转染与稳定转染表达劣势包涵体；无翻译后修饰；大分子量蛋白表达困难非人源糖基化；高甘露糖修饰周期长；成本高；缺少部分糖基化周期长；成本高推荐表达细菌类蛋白；抗原类蛋白；细胞因子；酶类细胞因子；小分子量蛋白；酶类细胞质蛋白；毒性蛋白；跨膜蛋白；分泌蛋白；激酶分泌蛋白；跨膜蛋白胞外区；重组抗体；抗体片段3 蛋白产品应用表达的重组蛋白常用于:（1）作为抗原制备抗体；（2）参与细胞实验与动物实验；（3）测定蛋白酶活；（4）研究蛋白相互作用；（5）研究蛋白结晶结构；（6）免疫组化实验；（7）药物蛋白研究、生产等。4 影响蛋白表达的因素（1）蛋白本身的特性：蛋白分子量大小、蛋白来源/物种、是否为毒性蛋白、蛋白翻译后修饰程度、蛋白自身结构的复杂程度；（2）宿主的选择：宿主本身的特性；（3）蛋白需求量：蛋白应用范围对应的需求量不同，所以要根据需求量确定表达系统；（4）质粒载体的选择：载体是携带外源基因的工具，要根据系统选择合适的载体才能使蛋白更好的表达；（5）融合标签的选择：蛋白重组表达过程中采用亲和标签融合达标由两方面作用，一方面是为了使蛋白纯化过程变得更加容易；另一方面是为了促进某些不溶性蛋白溶解；（6）蛋白表达系统的优化：重组蛋白实际表达过程中有可能会产生各种问题，因此表达系统的优化很重要。

1. Elisa双波长测量原理及方法

Elisa双波长测量原理：所谓单波长比色即通常以对显色具有最大吸收波长如450nm进行比色测定（以TMB为底物的试剂盒比色波长为450nm）；而双波长比色则是酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次。450nm-敏感波长下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度 与 板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；630nm-非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好使用双波长比色。双波长比色测定方法：1.每孔加TMB 显色液 100ul后，显色15-20min（盖上避光），加入50ul/孔终止液，5min以内放入酶标仪读数；2.读数时需要读取450，630nm两个波长下的吸光值，酶标仪型号功能不同读数过程稍有差异，可能有以下两种情况：A.自带双波长校正，可以同时读出450，630nm两个波长下的吸光值；B.不带双波长校正，就需要手动调整读两次，分别获得450，630nm两个波长下的吸光值；3.数据处理时，需要用450nm OD值减去 630nm的读数。（如果酶标仪没有630nm波长，也可以选用570nm）这种双波长比色减法可以修正板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等产生的吸光值，没有修正的读数可能会偏高，准确性也更低

2. ELISA试剂盒唾液样本的制备

ELISA试剂盒唾液样本的制备只要检测的生物体液样本中含有待测蛋白，且蛋白含量在试剂盒的检测范围内，理论上我们的试剂盒都是可以进行检测的，而且这些样本也在我们的售后范围内。唾液样本的制备：用唾液样本采集管收集样本，然后于2-8℃ 1,000×g离心15分钟，取上清即可检测，或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。注意：唾液一般饭后半小时内不易采集，因为刚进食的唾液中富含唾液淀粉酶，最好空腹时段采集。客户需要自己查文献或资料确认唾液中待测蛋白的含量，最好先进行预实验确定样本的最佳稀释比。

3. ELISA 组织样本处理方法

ELISA 组织样本处理方法ELISA（酶联免疫吸附剂测定）是一种快速、灵敏、准确可靠的一种定量分析方法，样本的处理对于 ELISA 实验的成功有着举足轻重的作用。 利用 ELISA 进行检测的样本类型包括常见的血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清以及不常见的皮肤组织、尿液、粪便、肺、泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等相关组织样本，这些样本收集的时间、处理方法和保存都会影响到 ELISA 实验的结果。下面就常见 ELISA 组织样本处理方法的整理。组织样本一般是制成组织匀浆，处理方法如下:1）取适量组织块，于预冷 PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）。2）可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入 5-10ml预冷 PBS(组织与 PBS 的质量体积比建议为 1:5，即 1g 样本加入 5ml PBS)进行充分研磨（有条件实验室可选用机器匀浆），该过程需在冰上进行；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复 2 次）。3）将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。4）如果样本需要长期保存，请添加蛋白酶抑制剂。根据实验需要，组织匀浆样本可先定量总蛋白，以便于统计分析数据。

4. ELISA 血清、血浆样本处理方法

ELISA 血清、血浆样本处理方法可用于 ELISA 实验的样本一般有血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法也不同。适当的样本预处理是确保 ELISA 实验正确性和准确性的第一步。这里，我们将重点介绍血清和血浆样本的处理方法。血清是 ELISA 实验最常用的样本，其预处理也十分简单。使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置 2 小时或 4℃过夜，分离出血清（建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清可以更大程度地分离出来）。4℃下以 1000×g 离心 20 分钟，小心收集上清液（血清），立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。 在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA 实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性 HRP，也会导致检测结果不准确。血浆 使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后 30 分钟内，4℃下以 1000×g 离心 15 分钟，小心收集上清液（血浆）。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存，避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括 EDTA(部分酶相关指标不建议使用），肝素钠，枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读 ELISA 试剂盒说明书，查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

5. ELISA试剂盒检测范围与灵敏度区别

ELISA试剂盒灵敏度与检测范围1 灵敏度：试剂盒能够检测到的样本最低检测限。以两个相互有关的量，即最低检出量和最低检出浓度来表示。自产ELISA试剂盒以最低检出浓度反应灵敏度。最低检出浓度越低，试剂盒灵敏度越高。如果待检样本中蛋白含量很低，需要选择高灵敏度的ELISA试剂盒。 试剂盒灵敏度=20个零孔OD值的平均值+2个标准方差2 检测范围：一般是标曲范围，指准确度为99%以上时样本所能涵盖的浓度范围。特别要注意待测样本蛋白浓度是否落在检测范围内，对于浓度很高的样本，可以先进行预实验摸索到比较好的稀释倍数后再大量测定样本。

6. ELISA样本处理方法（含血清 血浆 细胞上清 细胞 组织）

ELISA样本处理方法（含血清 血浆 细胞上清 细胞 组织）可用于ELISA实验的样本一般有血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法也不同。适当的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里，我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。1. 血清血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置2小时或4℃过夜，分离出血清（建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清可以更大程度地分离出来）。4℃下以1000×g离心20分钟，小心收集上清液（血清），立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。2. 血浆使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，4℃下以1000×g离心15分钟，小心收集上清液（血浆）。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存，避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括EDTA(部分酶相关指标不建议使用），肝素钠，枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书，查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。3. 细胞培养上清将细胞培养上清液吸入离心管中并以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液备用，样本保存在-20℃或-80℃，避免反复冻融。4. 细胞裂解液反复冻融方法1） 吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。 悬浮细胞可以省略该步骤。2） 将细胞悬浮液收集到离心管中，以1000×g离心10分钟，然后吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞 3次。

7. Elisa的原理

Elisa的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

8. 双抗体夹心法原理及操作步骤

双抗体夹心法原理及操作步骤双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

9. IF染色后不能立即观察，片子如何处理？

IF不能立即去观察，片子如何处理？若客户不能立即去观察，推荐如下：1、 优先推荐抗荧光衰减封片剂进行封片，保持环境的湿润度，避免干片，还需要遮光，这种保存得当的话可以保存1-2周或者更久；2、 次选甘油封片，保持环境的湿润度，避免干片，还需要遮光，这种保存得当的话可以保存1周左右。
注：还需避免片子被污染，比如染菌；可以加入少量抗生素

10. IF片子固定后不染色，该如何保存？

IF片子固定后不染色，该如何保存？客户问题：近期培养了一批原代神经元，数量多，染不过来，培养到一定天数的神经元，用多聚甲醛固定后，不能立即染色，该如何保存？保存期大概多久？1）如果是细胞孔板，固定后用缓冲液洗去固定液后，在孔板内加入过量含50%甘油的缓冲液，然后用封口膜密封好，平放置-20℃，保存2）用时取出放置室温复温15-30min，后用缓冲液洗涤去除甘油即可3）上述1-2条中提到的缓冲液，用PBS即可4）保存有效时间：3周左右，更长的时间我们公司没有做过探索

11. IHC常见问题及注意事项

一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1. 要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。3. 石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80℃的超低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。二、一抗的选择要点和技巧是什么？1. 单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。2. 应用范围的选择。有的一抗只能用于WB或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。3. 种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。4. 种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。三、在什么情况下使用Triton-X100？1. TritonX-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(10μm以上厚切片)和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。2. 其作用原理：TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。3. TritonX-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。四、封闭血清的选择原则是什么？1. 膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。2. 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。3. 也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。五、抗体孵育条件的比较？1. 一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃，1-2h，而4℃过夜和从冰箱拿出后37℃复温15-30min。2. 二抗一般室温或37℃，1h，具体时间需要摸索。六、一抗4℃孵育后为什么要进行37℃复温？1. 一方面，防止切片从4℃直接放入PBS易脱片。2. 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4℃和37℃时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。七、DAB显色时间如何把握？1. DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。2. DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。3. 若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。4. DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4℃过夜）；另一方面就是封闭时间过长。八、免疫组化结果如何分析？1. 阳性着色细胞计数法。在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3-6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。2. 灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用imageJ进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。3. 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1-4分为0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最终可以分数相加，再进行比较。九、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？1. 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。2. 修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种.

12. IHC实验原理

IHC实验原理 免疫组织化学（immunohistochemistry）是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。按样本处理方式一般分为IHC-P和IHC-F。

13. 石蜡切片和冰冻切片的比较

1. 要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。2. 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。3. 石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80℃的超低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

14. 如何最大限度地降低组织非特异性染色

1. 缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，单克隆抗体通常特异性会更好；3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5. 缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；6. 适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗孵育之后的浸洗尤为重要；7.防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。

15. 最新版IHC 实验标准操作流程

1.实验试剂1.1 缓冲液：0.01M PBS pH7.2±0.2; 0.01M pH7.2 PBST 1.2 抗原修复液： ① pH6.0 0.01M 柠檬酸修复液（1L）： C6H8O7•H2O 0.4g；NaC6H5O7•2H2O 3g；pH6.0； ② pH7.0 0.01M PBS 修复液（1L）： KH2PO4 0.07g；NaCl 7.89g；Na2HPO4 0.45g；KCl 0.10g；pH7.2-7.4； ③ pH8.0 0.05M Tris-EDTA 修复液（1L）： C4H11NO3 6.05g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.29g；用稀 HCl 调至 pH8.0； ④ pH9.0 0.01M Tris-EDTA 修复液（1L）： C4H11NO3 1.21g；C10H14N2Na2O8•2H2O 0.37g；pH9.0。 1.3 封闭液：5%空白山羊血清 1.4 抗体稀释液：1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100 1.5 3%过氧化氢（需新鲜配制，30% H2O2与 dH2O 体积比 1:9） 1.6 EnVision Systems 检测体系, HRP 显色系统： HRP RABBIT/MOUSE 及配套 DAB 显色液；2.7 脱蜡液、无水乙醇（分析纯）、去离子水（dH2O）、Mayer’s 苏木素、中性树胶封片剂。 2.实验步骤 2.1．水化/脱蜡 2.1.1 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入 55℃的恒温箱中烤片 30 分钟；同时将脱蜡液 1 缸一起放入55℃的恒温箱中； 2.1.2 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液 1 缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温， 5 分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液 2、脱蜡液 3、无水乙醇 1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。 注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。 2.2．内源性过氧化物酶灭活 将切片完全浸入到3%双氧水溶液中，室温，孵育10分钟；完成后流水清洗5分钟。 注意：内源性酶含量高的组织，可以延长灭活时间至15-20分钟；双氧水需新鲜配制，可提前5-10分钟配制 3%的双氧水。 2.3．抗原修复 2.3.1 微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热 3 分钟后停火，微波炉内静置 5 分钟；再高火加热 3 分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热 1 分钟后停火，微波炉内静置5 分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。待修复液温度降至室温后，用缓冲液 PBS 洗涤 3 次，每次 1min。 2.3.2 高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时 2 分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液 PBS 洗涤 3 次，每次 1min。 注意： ① 修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复完成后不可 快速冷却。 ② 初次检测优先使用 pH6.0 柠檬酸修复液高压热修复的修复方式；对于初次检测结果显示为阴性结果，若 WB 检测结果有条带，排除样本问题，细胞核和细胞膜定位选择 pH8.0 Tris-EDTA 修复液高压热修复的修复方式；细胞质定位的选择 pH7.0 PBS 修复液的旧微波热修复的修复方式；混合定位的按主要定位选择相应的次要修复方式，分别进行复检时的抗原修复。 2.4．染色： 2.4.1 封闭：去除切片上的缓冲液；在组织切片上滴加 5%空白山羊血清封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育 20 分钟； 2.4.2 一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液工作液稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于 4℃孵育过夜（也可 37℃，孵育 2 小时）；将孵育湿盒取出室温复温 15-30 分钟，去除抗体工作液，用缓冲液 PBST 洗涤 1 次，5 分钟；用缓冲液 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟； 2.4.3 二抗孵育：在组织切片上滴加二抗工作液后水平放置于孵育湿盒中，于 37℃恒温孵育 1h；去除切片上的溶液，用缓冲液 PBST 洗涤 1 次，5 分钟；用缓冲液 PBS 洗涤 3 次，每次 3 分钟；用蒸馏水洗涤 2 次，每次 3 分钟； 2.4.4 显色：显色前 5 分钟，配置 DAB 显色工作液（C 液:B 液体积比 1:100），充分混匀；在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，通常 10-60 秒即可得到合适的染色强度；将切片浸入大量 dH2O 中即可终止显色；切片入流水清洗 10 分钟； 2.4.5 复染、返蓝：将稍沥干的切片浸入 Mayer’s 苏木素中复染切片，用流水清洗 10 分钟。 注意：染色过程 4.1-4.4 步骤中需一直保持切片处于湿润状态；染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织；流水清洗时需避免流水直接对着组织，或水流过大，会造成切片掉片。 2.5．脱水、封片、镜检： 2.5.1 脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡 1 次，10 秒；高温（55℃-60℃）下完全干燥； 2.5.2 封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片。 2.5.3 普通光学显微镜下观察实验结

16. IP实验中二抗的选择（规避轻重链）

抗体的组成是有两条轻链和两条重链组成的，轻链大小在25KD左右，重链大小在55KD左右，二抗包括IgG(H+L)，IgG(high chain)，IgG(light chain)。由于在IP实验中磁珠和一抗耦联富集目的蛋白，最终做IB检测，在检测样本中包含了一抗成分和被检测蛋白，如果被富集目的蛋白大小接近25KD或55KD，就可能会出现被一抗干扰的情况，所以当进行IP实验时，需要根据目的蛋白大小选择规避轻重链的二抗，例如Bcl-2,实际分子量接近25KD，此时我们应该选择规避轻链的二抗，即识别重链的二抗。

17. WB实验基本原理

WB 实验基本原理 免疫印迹检测法（Western blotting）,又称蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学等生命科学研究中常用的的一种实验方法，其基本原理是通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳区分待测样品不同的组分，再在电流的作用下，使蛋白质从凝胶转移至固相载体（膜）上，通过特异性抗体作为探针，对靶抗原蛋白质进行检测，通过分析特异性反应的位置和强度获得特定蛋白质在所分析的细胞或（和）组织中表达情况的信息。

18. WB实验流程

WB实验流程 Western blotting 实验通常由 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的印迹和检测两个部分组成。第一部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 蛋白质的电泳分离是指带电粒子在电场作用下,向着与其所带电荷相反的电极移动的现象，各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶。如果在电泳体系中加入十二烷基硫酸钠（SDS），则电泳迁移率主要依赖于分子量，与所带的净电荷和形状无关。这种电泳方法称为 SDS-PAGE，主要用于测定蛋白质亚基分子量。 2. 电泳启动后，蛋白样品先在浓缩胶中运动，由于浓缩胶孔径大，蛋白质运动受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上层，全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，因单位质量带负电荷多者迁移快，反之则慢，即分子量小的蛋白迁移快，分子量大的蛋白迁移慢；由于分离胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，因而蛋白质在电泳过程中最终达到彼此分开。 3. 由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过的可移动样品蛋白质的分子量也不同。选择一定的凝胶浓度，即选择合适的凝胶孔径，可使待分离样品蛋白质的泳动速率差异最大，得到最佳分离效果。通常根据被分离蛋白质的分子量范围选择凝胶浓度。 凝胶浓度与蛋白质分子量测定的关系注：X为目的蛋白的大小第二部分：蛋白质的印迹和检测 蛋白质的印迹和检测包括五个步骤： 转膜→封闭→孵育一抗→孵育二抗→蛋白检测（显色）和分析 1. 转膜 蛋白质印迹首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（膜）上，即转膜。最常用的固相载体（膜）主要是硝酸纤维素（NC）膜和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。硝酸纤维素（NC）膜与蛋白质之间靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便；但结合在NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 μm 和0.2 μm 两种规格的NC 膜，大于20 KD 的蛋白可用0.45 μm 的膜，小于20 KD 的蛋白就要用0.2 μm 的膜。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。 常用的转膜方式分为半干转和湿转两种。 半干转即将装有凝胶、膜和滤纸的“三明治”的凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜和凝胶上，所以其转移条件比较严格，但其转移时间短，效率高。 湿转即将装有凝胶、膜和滤纸的“三明治”的凝胶夹层组合卡在转移槽内，垂直悬浮在缓冲液中，利用与凝胶夹层平行的电极板的高强度电场将蛋白质从凝胶转移至膜上。其优点是可以对蛋白质进行有效转移，转移时间可适当延长获得更完全的转移，且可以同时转移几块胶的蛋白质。 2. 封闭 转移成功后的膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的背景染色，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20，缓冲溶液是TBS或PBS。 惰性蛋白质BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或非离子去污剂Tween-20封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween-20这种非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。 封闭剂选择： a 脱脂奶粉是最常用的经济配方,常用的封闭剂还有BSA b 脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建议使用BSA。 c 脱脂奶不适用于碱性磷酸酶(AP)检测系统。 d 如果用辣根过氧化物酶(HRP)检测系统，封闭液不应加叠氮钠(NaN3)，因为叠氮钠对辣根过氧化物酶（HRP）有灭活作用。 e 如果用二抗抗体是碱性磷酸酶(AP)标记的检测系统，可使用酪蛋白封闭，同时须选择TBS缓冲溶液，不可使用PBS缓冲溶液，因为PBS缓冲溶液干扰碱性磷酸酶。 3. 孵育一抗 检测目标蛋白质的特异性一抗抗体和封闭后的膜进行孵育，膜上的目标蛋白质和一抗抗体发生特异性的结合。 在免疫印迹实验中，一抗抗体应该提前选定。一抗抗体取决于被检测的抗原蛋白质。免疫印迹一抗抗体包含单克隆抗体(MAbs)和多克隆抗体(PAbs)。单克隆抗体(MAbs)识别单个抗原表位,具有更高的特异性,可有效降低背景;但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果。 多克隆抗体可识别多个抗原表位，通常具有更高的亲和力，即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果。 4. 孵育二抗 特异性酶标记的针对一抗抗体的二抗抗体和孵育一抗后的膜进行孵育，膜上一抗抗体（已和目标蛋白质特异性的结合的）和二抗抗体发生特异性的结合。 大多数一抗抗体的来源是小鼠或兔，因此抗鼠免疫球蛋白和抗兔免疫球蛋白是最常见的二抗抗体。山羊是最常见的用于生产多克隆抗小鼠和抗兔抗体的动物，所以山羊抗鼠免疫球蛋白和抗兔免疫球蛋白是最常见的二抗抗体。选择二抗抗体取决于一抗抗体的动物来源。例如,如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体,二抗抗体必须是抗小鼠的抗体；如果一抗抗体是兔来源多克隆抗体,二抗抗体必须是抗兔的抗体。 5. 蛋白检测（显色）和分析 （1）蛋白检测（显色）： 酶标记的二抗和合适的底物发生反应，生成有颜色的产物，即可见的蛋白区带，通过分析特异性反应生成的可见蛋白区带的位置和强度即可获得特定蛋白质在所分析的细胞或（和）组织中表达情况的信息。 在酶标二抗抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶(HRP)。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以H 2 O 2 为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶H 2 O 2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 （2）结果分析： a 对照设计 成功进行 Western Blot 检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到 Western Blot 的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性。 一般需要设置的对照如下： 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率。 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性。 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性。 内参对照：检测标本的质量和二抗系统。 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。 b 内参 内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在 Western Blotting 中使用内参其实就是在免疫印迹过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。此外内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blotting 显色或者发光体系是否正常。 选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显，可同时进行检测；当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体检测，然后使用印迹膜再生液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体检测。

19. WB无带原因分析及解决方法

WB无带原因分析及解决方法在Western Blot实验中当出现无带时，可能的原因及解决方法有以下几种：可能原因；解决办法；一抗和二抗失效；更换抗体，选择现配现用的工作液；一抗和二抗不匹配；二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来源为兔，二抗选择抗兔抗体）；抗体效价低；增加抗体浓度，延长孵育时间，增加上样量，延长曝光时间；蛋白转移不充分；延长转膜时间；蛋白无表达，表达量低或上样量低；设置阳性对照，确定样本中是否含有目的蛋白；洗膜过度；勿过度洗膜。

20. WB条带弥散的可能原因及解决方法

WB条带弥散的可能原因及解决方法原因解决方法抗体浓度太高降低抗体浓度蛋白质上样量太多降低蛋白质上样量迁移过快、电泳温度过高降低电泳速度，低温电泳（冷室）

21. WB高背景的可能原因及解决方法

WB高背景的可能原因及解决方法可能原因解决方法抗体浓度太高优化降低一抗和二抗的浓度二抗聚集0.2um 膜过滤或更换新二抗抗体孵育温度过高4℃孵育封闭液不适合比较尝试不同的封闭液二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度一抗或二抗与封闭剂有交叉反应在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 减少交叉反应封闭不完全增加封闭液中蛋白质浓度优化封闭时间和温度（常温2小时或4℃过夜）封闭液中加入浓度0.05％Tween20抗体稀释液中加入浓度 0.05％Tween20封闭不充分 延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）抗体与其它蛋白质交叉反应更换不同的封闭液；勿在含生物素体系中使用脱脂奶粉封闭降低二抗浓度检测二抗与膜的交叉反应性漂洗不完全 增加漂洗时间和缓冲液体积漂洗液中加入浓度 0.05％Tween20曝光时间太长缩短曝光时间膜的问题使用干净镊子；戴手套操作换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润孵育时使用脱色摇床避免膜重叠，互相覆盖小心操作，勿毁损膜洗膜不充分增加洗涤次数膜不合适NC 膜比 PVDF 膜背景低缓冲液污染使用新缓冲液过滤缓冲液仪器污染保证所有仪器，用具干净确保膜上无残留胶

22. WB非特异性条带的可能原因及解决方法

WB非特异性条带的可能原因及解决方法可能原因解决方法SDS非特异性结合到胶上的蛋白质转膜后充分清洗细胞传代次数过多，使其蛋白表达模式的分化使用原始或传代少的细胞株，或平行实验蛋白样本降解使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂一抗浓度过高在满足一定的敏感性的情况下，降低一抗浓度二抗引起的非特异条带免疫球蛋白是一个超家族，而标本中含有大量的类似球蛋白的抗原，容易和二抗引起反应；尤其是在变性的情况下，在满足敏感性要求的前提下，荧光标记一抗，酶标兔抗荧光就可以解决这个问题上样量过高适当减少上样量洗涤不完全可适当延长洗涤时间封闭不好延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液

1. JAK-STAT信号转导

JAK-STAT信号通路Jak（Janus 激酶） 和 Stat（信号转导蛋白和转录激活剂）蛋白被多种配体的受体所使用，其中包括细胞因子、激素、生长因子和神经递质 。Jaks 和 Stats 在癌基因、肿瘤进展、血管生成、细胞运动、免疫应答和干细胞分化中具有重要作用.

2. 缺氧因子HIF-α信号转导

缺氧因子HIF-α信号转导 HIF1 调节诸多基因类型转录，这些基因可促进低氧环境的反应，包括调节血管生成、红细胞生成、细胞周期、代谢和凋亡的基因。HIF-α涉及多条信号通路，附件内容主要包含了Warburg 效应 和 Angiogenesis产品list。

3. 染色质重塑差异标志物

染色质重塑差异标志物问题：表观修饰的表征，指示染色质重塑差异的标志物回复：染色质关闭标志 HP1 H3K9me3 H3K27me3 染色质开启标志 H3K4me3相关资料：1、什么是染色质重塑染色质重塑（Chromatin Remodeling）是一个重要的表观遗传学机制，基因表达的复制和重组等过程中，染色质的包装状态、核小体中组蛋白以及对应DNA分子会发生改变的分子机理。2、基因转录调控

4. 铁死亡实验检测流程

铁死亡实验检测流程1、首先是探索阶段，进行造模处理，造模有多种方式，如：利用铁死亡诱导剂（建议推荐Erastin（间接造成GDH的缺乏），Fin56(作用于SQS和GPX4的强效诱导剂)等）；2、造模后需进行铁死亡测定，通过添加铁死亡抑制剂（如：DFO(铁螯合剂)和铁的抑制剂(Fer-1或Lip-1)）抑制铁死亡，再通过CCK8试剂盒等方法对细胞存活比例进行分析，确定细胞存活比例；3、铁离子水平测定，用探针phen Green SK荧光探针、Iron assay（生化试剂盒）（Iron Assay试剂盒(Colorimetric) (ab83366)）；4、脂质氧化水平分析，联合C11-BODIPY染色测的和MDA测定；5、最后得出细胞确实发生了铁死亡，则进一步进行验证阶段，可以推荐抗体产品，铁稳态调节（TFRC、FTH、FTL）,氧化还原态（GPX4、NRF2、ALox5），GSH稳态调节（XGT，GCLC）。

5. 铁死亡测定试剂-C11 BODIPY 581/591 脂质过氧化荧光探针

C11 BODIPY 581/591 脂质过氧化荧光探针C11 BODIPY 主要是用于活性细胞的脂质氧化状态的测定，氧化还原酶把C11氧化成荧光素基团后，能发光。若用于组织样本检测，组织样本经过固定后，组织里的细胞处于失活状态，氧化还原酶失去活力了，其脂质的氧化水平也就没法测定。客户用于FC检测时，可以用FITC和PE通道检测总结：C11 BODIPY只能检测细胞，不能用于组织样本相关产品：RM02821 C11 BODIPY 581/591 脂质过氧化荧光探针

6. 铁在铁死亡信号通路中介绍

铁死亡信号简介 铁死亡的发生主要是由于铁依赖性的细胞膜脂质过氧化，铁死亡的调节机制以及其主要的调节因子（System xc-转运体、AA/AdA、LIP）。铁的主要毒性作用基于其在Fenton反应过程中诱导自由基形成的能力，从而导致脂质过氧化和细胞死亡。1.首先是AA / AdA在ACSL4催化作用下与CoA结合形成AA / AdA-CoA衍生物，从而促进其酯化为磷脂，接下来，（LPCAT3）催化AA / AdA-CoA和膜PE的生物合成，形成AA / AdA-PE，磷脂膜。2.过量的细胞内铁会通过Fenton反应生成ROS，脂质氢过氧化物是ROS的有害产物。氧化还原活性Fe2+（LIP)的量是通过Fenton Chemistry形成PL-OOH的一个关键因素；PL-OOH的积累是铁死亡的一个标志，而铁死亡的发生与转化成磷脂的AA/AdA的量密切相关；3.GSH分子作为电子供体，可在GPX4作用下将磷脂过氧化物(PL-OOH)还原为相应的醇，同时生成氧化谷胱甘肽(GSSG)；GSSG又可被谷胱甘肽还原酶（GSR）利用NADPH还原为GSH，形成循环GPX4必须使用GSH作为辅因子，以将脂质过氧化物还原为相应的醇，当GSH消耗殆尽时，脂质过氧化物在体内积累，引起细胞膜脂质过氧化，引起铁死亡。 Fe2+与不同过氧化物发生氧化还原反应生成羟基(•OH)或烷氧基(RO•)2种自由基；Fe3+可以通过超氧化物(•O2-)生成氧分子(O2)循环生成Fe2+，即 Fe3+ 与 超氧化 物(•O2-) 发生氧化还原反应生成 Fe2+和 氧分子(O2 ) ，氧分子(O2 ) 又在 呼吸作用和一些特定的酶的作用下生成 超氧化物(•O2-) 。

7. 铁稳态调节

铁离子稳态调节 肠细胞从膳食中吸收的非血红素来源的3价铁离子，在十二指肠细胞色素b还原酶（Dcytb）作用下还原为亚铁铁2+，2价铁离子通过DMT1转运蛋白进入细胞质，。细胞内Fe2+最后通过FPN1输出到血液中，FPN1铁转运蛋白是唯一高度保守的亚铁转运蛋白，允许铁从胞质内介质传递到细胞外介质。由FPN-1输出的Fe 2+被肝素（HEPH）氧化为Fe 3，，FE3+装载到转铁蛋白（TF）上，带有两个Fe 3+的运铁蛋白与大多数细胞表面表达的TFR1受体，形成的复合物（TFR1 / TF-Fe 3+）被内吞，在酸性环境下，复合物会释放Fe 3+，释放的Fe 3+被还原酶STEAP3还原为亚铁，然后由DMT1转运通过内体膜形成不稳定的铁池，形成的LIP被用于线粒体和细胞的各种目的，例如DNA合成，血红素和Fe-S中心的生物发生。，伴侣蛋白PCBP1和PCBP2（Poly [rC]结合蛋白1/2）是多功能的衔接子蛋白，可结合多余的铁由FPN-1和相关的铁氧化酶输出到血液中并或将其传递至铁蛋白（FTH/FLH）进行存储。NCOA4介导的铁蛋白吞噬作用，通过释放铁蛋白来增加细胞内铁水平。在基础条件下或铁缺乏时，Fe 3+铁会存储在铁蛋白中，NCOA4识别铁蛋白并将其传递至吞噬细胞，铁蛋白释放出Fe3+，将2价铁离子转运到细胞质中；在富铁条件下，NCOA4被HERC2识别，以铁依赖性方式靶向，被蛋白酶体降解。细胞中铁水平的调节是由铁依赖性蛋白网络维持的，铁蛋白中储存了过多的铁。当摄入减少时，其生物利​​用度通过溶酶体中铁蛋白的降解和释放而得以维持。

8. 铁死亡抑制剂常见问题

1.抑制剂浓度的选择：（1）细胞系使用浓度可依据文献上的使用浓度参考，一般使用范围0.5umol~2umol,（2）依据细胞EC50的剂量参考，使用10倍剂量。2.通路选择不同，本公司铁死亡抑制剂通路为膜上的脂质过氧化通路，需区别铁离子螯合剂。3.铁死亡是否诱导为膜上脂质过氧化，细胞内的ROS也可引起细胞凋亡，而只有发生了细胞膜上的脂质过氧化才可确定为细胞发生铁死亡。

9. 铁死亡测定试剂-C11 BODIPY 581/591 脂质过氧化荧光探针实验步骤

C11 BODIPY 581/591 脂质过氧化荧光探针实验步骤 将人骨肉瘤细胞(U-2 OS)铺在35mm玻璃底皿(MatTek)上，在37℃完全生长培养基中用10μM 脂质过氧化传感器染色30分钟。对于生育酚处理，将细胞进行用150μMα-生育酚处理30min。然后在37℃下用培养基(DMSO)、100μM 甲萘醌、200μM过氧化叔丁基(TBHP)或100μM过氧化异丙烯(CH)处理细胞，37℃处理2小时。在最后30分钟的复合孵育过程中，用Hoechst 33342染色。然后将细胞用磷酸盐缓冲盐(PBS)洗涤3次，然后在Zeiss Axiovert倒置显微镜上成像，使用40倍的物镜，使用Hoechst、FITC和Texas Red channels通道的滤光片。然后使用SlideBook 5.0软件对信号进行定量分析，并利用590至510通道的信号比值来定量细胞中的脂质过氧化。在对照细胞中，大部分信号是红色通道，590/510的比率很高。当细胞用活性氧生成试剂(如甲萘醌、TBHP和CH)处理时，比值较低。从生育酚预处理样品中增加的比例可以看出，生育酚预处理降低了细胞中的脂质过氧化。

10. 炎症引起铁死亡相关靶点推荐

炎症引起铁死亡相关靶点推荐炎症本质：炎症因子引起的免疫激活，经典炎症因子IL1β IL6 TNFa IFN家族（如IFN-γ），炎症因子含量测定，可推荐ELISA试剂盒炎症相关信号通路：JAK-STAT 下游重要分子stat3，NFKB炎症与铁死亡通路图：关键靶点stat3 Cathepsin B;TFRC FTH(铁稳态）

1. RM09014转染试剂转染贴壁细胞操作方法

RM09014转染试剂转染贴壁细胞操作方法RM09014|HighGene transfection reagent 转染贴壁细胞时，是否需要悬浮后转染？自产转染试剂转染贴壁细胞时，按照说明书要求，正常细胞转染操作就行，不用悬浮后转染。如果细胞转染效率不高，可以再尝试将细胞悬浮后再转染，可以增加转染效率。RM09014说明书中关于转染悬浮细胞方法摘抄如下：

2. 蛋白marker介绍

蛋白marker介绍第一代：普通marker普通蛋白Marker，也叫预混合（pre mixed）蛋白分子量Marker，是简单，也是准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是早期判断蛋白大小必备产品。普通Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有一个或者几个条带加倍浓度作为区别，用于帮助判断每个条带的大小。按照条带的分子量大小通常有三种：宽分子量蛋白Marker、高分子量蛋白Marker、低分子量蛋白Marker。从实验总体考虑，应该选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的风险。不过，条带越多，价格可能也会越贵。如果购买的是大包装，应进行分装，需要考虑到反复冻融对蛋白的伤害。第二代：预染marker 预染Marker，是将Marker的蛋白，通过与染料共价耦联，在电泳过程中或者转膜时可以肉眼直接观察到的一种蛋白分子量Marker。预染Marker有很多优点，得到了广泛的应用，有效实现了在电泳时、电泳后，以及转膜后对电泳情况的监测和迁移率的估计。但是它也存在一定的缺陷，当预染蛋白Marker与染料共价耦联时，在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能会导致一些偏差，所以不太适合定位蛋白。预染Marker可以分为两种：单色预染和多色预染（又称为彩虹Marker）。单色的Marker通常是利用其中某些条带加倍浓度来提示其大小的，观察起来不是很方便。彩虹Marker（PR1910），比较容易区分条带的大小。第三代：曝光marker 曝光Marker，就是终的Marker条带会和检测目标蛋白会一同出现在显色的图片中。原理是每个条带蛋白都含有IgG结合位点，可以与人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊以及兔子来源的IgG恒定区结合，因此在实验过程中这些蛋白可以直接或间接地结合二抗，与实验样品信号同时在X胶片上曝光显色。由此可以更方便准确地判断实验样品信号的位置和大小。由于曝光Marker和目的条带是出现在同一图片中，而不是后期的拼接，这样的结果更让别人信赖，因此现在很多知名期刊在收录文章时都会要求使用曝光Marker，但是曝光Marker也存在一定的缺陷，就是非预染的。不过整体而言，它还是很值得推荐的。ABclonal 蛋白marker产品：RM19001|ColorMixed Protein Marker 180 (10-180 kDa) 为第二代预染marker

3. 案例分析：Marker下方飘了不是直线，呈三角形（marker蛋白质标记物不完全转移到膜上）

反馈问题：Marker下方不是直线，呈三角形客户实验结果： 1.有很多可能会导致蛋白质标记物不完全转移到膜上，例如凝胶凝结不足或不均匀，电泳和转移条件差异，或者电泳或转移缓冲液的成分差异。另外也应考虑被蛋白酶污染的可能。 2.如果是由于转膜条件差异引起的，建议如下： A.建议在传输缓冲液中使用正确比例20％的甲醇，因为过高或过低的甲醇浓度可能会降低转膜效率​​。电泳时内外槽皆使用新鲜配制电泳液，避免过度重复使用电泳液甲醇挥发造成转膜效率降低。 B.检查缓冲液的组成是否正确。 10X缓冲液配方： Tris base 30.0 g, Glycine 144.0 g. 用ddH2O将体积调至1L。 将10倍传输缓冲液稀释至1倍使用： 100 ml 10X缓冲液，700 ml ddH2O和200 ml甲醇 *可以将SDS添加至0.01〜0.1％以促进高分子量蛋白质的转移。 C.避免在转膜过程中凝胶过热。使用前，将1X缓冲液冷却至4°C。 D.请检查TBST缓冲液中Tween 20的浓度不高于0.1％（通常为0.1％或0.05％），因为太高的Tween 20会干扰蛋白质标记物与膜之间的结合。 E.将NC或PVDF膜和滤纸预先浸泡在转移缓冲液中。如是使用PVDF膜，在浸入转移缓冲液之前，先在甲醇中激活。不同膜转膜效率不同，更换膜的材质在同样转膜条件下，可能造成转膜效率改变。 F.小心地除去凝胶/膜上的气泡和过量的缓冲液。 G.如果转移三明治太松，请添加更多的滤纸将转移三明治紧密组装。 3.这种现象是否有再现性?是否发生转膜前高分子的条带强度不均或偏弱，如是，推测可能产品在使用过程中被蛋白酶污染。 建议:A.每次采样都使用新的吸头，并清洁设备以避免蛋白酶污染。B.使用新鲜的电泳缓冲液，并避免过度使用电泳缓冲液。4.较小的可能是由于电泳条件差异引起的，则应考虑SDS-PAGE和电泳缓冲液的组成。建议：A.请检查电泳中蛋白质标记物是否分离良好。如果不是，请确认APS和TEMED是否新鲜，并重新准备电泳胶。检查丙烯酰胺百分比是否正确。B.确认用于堆栈凝胶和分离凝胶的缓冲液组成和pH值正确。C.检查电泳缓冲液的组成是否正确。10X Tris-Glycine缓冲液：30.0 g Tris base, 144.0 g Glycine, 10.0 g SDS.用ddH2O将体积调至1L。1X缓冲液：用900 ml ddH2O稀释100 ml 10X缓冲液。D.在内槽和外槽中均使用新鲜的电泳缓冲液，并避免过度使用电泳缓冲液。E.避免电泳中凝胶过热。

4. 案例分析：蛋白marker转膜正常，一抗二抗孵育之后洗膜marker颜色越来越浅。

蛋白marker转膜正常，一抗二抗孵育之后洗膜marker颜色越来越浅。洗膜时影响蛋白质标记物在膜上附着的主要因素如下：（1）Tween 20浓度（2）洗涤条件（时间，时间，温度，转速）（3）洗涤缓冲液的缓冲液组成由于各家条带有其强调的各自的特色，会有其较适合的洗膜条件，我司条带在适合的洗膜条件下能维持锐利清晰的特色，我司蛋白质条带建议清洗缓冲液中使用Tween 20浓度为0.05〜0.1％，并在室温或4℃下洗膜，每次5-10分钟*3次，转速<50 rpm。1XTBST溶液浓度的配方如下（用HCl将pH调整为pH 7.4–7.6）：[Tris]：20 mM[NaCl]：150 mM[Tween20]：0.05-0.1％（w / v）请注意Tween 20非常粘，由于粘在吸管尖上，可能会意外地将其过多地添加到清洗缓冲液中，高浓度的Tween 20容易导致蛋白质洗脱。另外，清洗膜的时间过长和速度过快也会导致目标蛋白洗脱。

5. 案例分享：蛋白marker在跑胶过程中，分子量大的条带变得模糊，分子量小的条带清晰。

蛋白marker在跑胶过程中，分子量大的条带变得模糊，分子量小的条带清晰。Marker被蛋白酶污染会发生降解，导致分子量大的条带变浅甚至消失，建议缓冲液不要反复使用，操作过程中要勤换枪头。

6. 蛋白酶K的应用场景

蛋白酶K的应用蛋白酶K：是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。能切割脂肪族（丙、缬、亮、异亮、蛋、天冬、谷、赖、精、甘、丝、苏、半胱、天冬酰胺、谷氨酰胺）和芳香族（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）氨基酸的羧基端肽键。PS：不含组氨酸、脯氨酸。不受EDTA影响，在尿素、盐酸胍、异硫氰酸胍、SDS等去污剂中均有活性。蛋白酶k还可以裂解古细菌的细胞壁上的蛋白，但不足以完全裂解，还是需要有氢氧化钠，SDS辅助一起的才行的。

7. THP-1细胞培养条件

THP-1 培养条件细胞： THP-1名称：白血病细胞单核细胞生长状态：悬浮生长培养基： 1640血清浓度： 10%FBS传代比例： 1:2生长周期： 2-3 天细胞传代：当细胞密度达到 1*106cell/ml 左右时，可进行传代。直接将细胞吹打混匀后，取1/2 体积的细胞悬液到新的培养瓶中，再补充等体积的新鲜培养基，放置在 37℃， 5%CO2培养箱中培养。传代时也可以将细胞悬液取出，离心，弃掉上清，加入两倍体积的新鲜培养基重悬细胞，再分装到两个培养瓶中进行培养。注意事项： THP-1 细胞比较喜欢酸性的培养条件，所以传代时尽量保留原始培养基，可在传代 2-3 次后更换新的培养基。

8. 影响转染效率的因素

影响转染效率的因素转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分为物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节。 公司产品HighGene转染试剂是一种新型高效的阳离子聚合物。它可以与核酸（包括质粒、siRNA、寡聚核苷酸）相互作用形成一种复合物将核酸转运到真核细胞内，适用于大部分真核细胞的细胞转染。关于阳离子转染试剂使用注意事项如下： 1、血清A、DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。B、一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。C、对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用专用转染试剂。有条件的话，可以用无血清培养基代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。2、抗生素(PS)抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，ICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。3、细胞状态 这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。细胞复苏后的3代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化。大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。4、细胞铺板密度用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为1×106细胞/ml，确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。细胞的融合度必须要达到90%才能做。5.启动子的选择获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子，如SV40和RSV(劳斯肉瘤病毒)相比，在BHK-21中其活性最高。这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白细胞)中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。6、DNA量高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要。转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于300ng/ul。产物表达，48小时mRNA表达最高;72h蛋白表达最高。

9. siRNA转染推荐使用量单位理解

我们转染试剂做siRNA转染时，推荐的是pmol单位，对于有客户提到的一般使用是nmol级别。这个是单位换算导致的理解错误，我们推荐的pmol是物质的量，客户说说的nmol是指浓度，单位是nM(nmol/lL)，本质是一样的，以6孔板为例，我们推荐转染siRNA是100pmol，6孔板中细胞培养基是2mL，那么siRNA的浓度就是50nmol/L，简称50nM。