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货号: RK21114
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产品信息

产品描述
5'…GCCNNNN/NGGC...3'
3'…CGGN/NNNNCCG...5'
产品应用
限制性酶切
产品保存
-20°C
产品组分
组分名称浓度2,000 U10,000 U
BglI10,000 U/mL200 μL1 mL
10x Buffer CutS10x1.25 mL4 × 1.25 mL

FAQs

Q1:双酶切有哪些注意事项?

能使任意两种酶在其中保证100%活性并降低星号活性的影响;

按照推荐条件建立反应体系。反应体系中甘油的浓度应<5%以避免星号活性;

在推荐反应温度、时间下孵育,双酶切反应不建议孵育过夜;

如果需要两种不同温度孵育,加入第一种酶在推荐的温度下孵育,如Smal (推荐反应温度25℃),热失活第一种酶后再加入第二种酶,按推荐温度孵育。

载体质粒DNA线性化,用于无缝克隆;产生粘性末端,用于传统分子克隆;质粒DNA模板线性化后,再用于ddPCR扩增;用于DNA基因组物理图谱的组建;基因的定位和基因分离;DNA分子碱基序列分析;比较相关的DNA分子和遗传工程。

星号活性(star activity):也称星活性,在非理想的条件下,切割与识别位点相似但不完全相同的序列,这一现象称星号活性。这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性,如果提供给相应反应条件,所有内切酶都会出现非特异性切割。

降低星号活性方法:控制甘油浓度(<5% v/v);控制酶与底物DNA比例 (不同的酶情况不同,防止酶量过大);低盐浓度(<25 mM);保持合适的pH值;去除有机溶剂(如DMSO、乙醇等);防止其他二价离子替代镁离子(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等)。以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感,而后者则对高pH值更敏感一些。

高甘油浓度(≶5% v/v):酶储存液含50%甘油因此两量不超过反应体积的10%。选择50 μL的标准反应体系,以减少反应过程中水的蒸发而提高甘油浓度。

使用非限制性内切酶最合适反应缓冲液:尽可能使用推荐缓冲液,离子浓度和pH的改变会引起星号活性。

存在有机溶剂(如DMSO、乙醉、DMF等):确保样品在制备过程中不含任何有机物,如DNA制备过程中可能混入的乙醇。

混有其它二价离子(如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+):去除样品中二价离子。

大多数限制酶对DNA甲基化敏感,因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时,对酶切的影响有3种可能,即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性,因此,为有效的切割DNA,必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。另外,大部分商业限制酶可用于切割甲基化DNA。

A1:限制性内切酶活性下降:用已知含目的酶切位点的对照DNA测试该酶活性;酶贮存于20°C,-70°C时会冻结避免反复冻融降低酶活;可根据实验要求适当加大酶。

A2:限制性内切酶稀释不正确:用酶存储液或反应缓冲液稀释酶。

A3:DNA不纯,反应条件不佳:纯化DNA;按比例使用新鲜缓冲液重复实验;按照推荐方案进行双酶切或分步酶切等调整到最佳反应条件。

A4:限制性内切酶识别的DNA位点上碱基被甲基化或存在其它修饰:换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶,重新将质粒DNA转化至dcm-、dam-基因型的菌株;将该DNA底物与λDNA混匀进行酶切验证。

A5:部分反应溶液粘在管壁上:全部酶切组分加入完成后,进行混匀并短暂离心。

A6:限制性内切酶含有甘油,粘度大导致取样不准:将酶稀释,增大取样体积。

A7:DNA底物酶切产生的粘性末端退火:电泳前将样品置于65℃孵育5-10 min,然后迅速冰浴。

A8:反应溶液、温度或强烈振荡致使酶变性失活:使用推荐的反应缓冲液及温度,避免强烈振荡。

A9:过度稀释使酶活性降低:适当稀释酶液,反应液稀释的酶液不能长期保存。

A10:反应条件不合适:使用推荐反应体系。

A11:识别位点两侧含有影响酶切效率的序列:增加5-10倍的酶量。

A12:DNA浓度不合适:推荐50 μL反应体系酶切1-2 μg DNA;DNA过量时可适当增加酶量。

A13:DNA被抑制剂污染:与对照DNA样品一起酶切,验证其是否被抑制:重新纯化DNA样品。

A14:DNA可能形成超螺旋:不同酶对超螺旋结构DNA消化效率不一样,可适当加大酶量。

A15:识别位点过于接近DNA末端:一般在识别位点两端各加3个保护碱基可确保酶切效率。

A16:识别位点不存在:验证DNA序列。

A1:酶失活:使用经过验证的酶切底物检测酶的活性。

A2:DNA底物中含SDS、酚、EDTA等抑制物:纯化DNA。

A3:反应条件不合适:检查反应Buffer与反应温度是否是最佳的。

A4:DNA酶切位点被甲基化:换用对该位点甲基化不敏感的同裂酶,或者将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的感受态细胞,重新提取质粒DNA。

A5:DNA位点上存在其它修饰:将DNA底物与λDNA混匀后进行切割验证。

A6:DNA底物不存在该酶的识别位点:换用其它酶切割DNA或过量酶消化进行验证。

A1:内切酶星状活性:检查反应条件:甘油浓度大于12%,盐度过低,Mn2+的存在及酶/DNA比值过大均可导致星状活性,降低酶的使用量。

A2:其它内切酶污染:用λDNA作底物检查酶切结果。

A3:底物中含其它DNA杂质:电泳检查DNA,换用其它酶切,纯化DNA片段。

A1:DNA定量错误(如RNA含量较高):用无DNase的RNase A消化DNA样品,纯化后再定量。

A2:在酶切反应液中形成非特异性的沉淀:在反应前纯化DNA样品。

A1:保存温度不合适:内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中,应在-20℃低温保存。

A2:以稀释形式保存:稀释酶液不宜长期存放,应一次使用。

A3:贮藏缓冲液不适当:使用厂家推荐的贮藏缓冲液。

A4:低蛋白浓度:内切酶与500 μg/mL的BSA一起保存。

A1:含磷酸盐的浓度高:纯化DNA样本去除磷酸盐。

A2:酶失活不全或含有ATP酶:延长灭活时间或纯化DNA。

A3:平末端连接:增加T4 DNA连接酶的用量。

A4:外切酶污染:减少酶用量,缩短反应时间,纯化回收DNA。

A5:连接缓冲液中ATP降解:重新配制连接缓冲液,或向连接反应Buffer中补加ATP。

A1:DNA结合有蛋白质:电泳前将酶切产物在65℃处理5 min,并加入0.1%的SDS,然后纯化。

A2:酶中含有DNA外切酶:减少酶用量或消化时间,换用新包装的酶。

A3:核酸酶污染:制备新的底物样品;使用新的缓冲液和水。

A4:电泳条件不合适:使用新鲜的电泳缓中液和凝胶;合适的电流电压避免过热。

说明书

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