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2X 无缝克隆预混液 (RK21020)

货号: RK21020
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产品信息

ABclonal MultiF Seamless Assembly是一种简单、快速并且高效的DNA无缝克隆技术,可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。使用任意方式将载体进行线性化,在插入片段正/反向PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列,使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的同源序列(overlaps,15 bp - 25 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后,在特定酶混合物的催化下,50℃反应15-60 min即可进行转化,完成定向克隆。
ABclonal MultiF Seamless Assembly Mix作为新一代的无缝克隆试剂,专门针对多片段无缝组装反应进行优化,可以一次实现多至5个插入片段的特定顺序组装克隆。使用该试剂,无需考虑插入片段自身携带的酶切位点。2X预混液包含高度优化的反应缓冲液及增强的酶混合物,可显著提高片段无缝组装效率与对杂质的耐受度,使得线性化载体与插入片段不进行纯化直接用于无缝克隆成为可能,极大的简化了实验步骤。无缝组装后的产物是完全封闭的双链DNA 产物,可直接用于下一步PCR、RCA 或其它分子生物学操作(例如转化入感受态细胞)。该方法可成功组装包含15 bp-80 bp末端一致序列的片段,可以组装长达上百kb的DNA片段。

应用无缝克隆
产品组分
  • 2X MultiF Seamless Assembly MixRM20523
保存温度-20°C
Unit Assay ConditionsRM20523,2X MultiF Seamless Assembly Mix|

FAQs

Q1:MultiF Seamless Assembly Mix可以组装多大的片段?

可以将5 kb的片段组装入15 kb的载体中,总长度高达20 kb。

一次反应可以组装的DNA片段数量依赖于片段的长度和序列。MultiF Seamless Assembly已经被证明可以成功将12个0.4 kb片段一次性插入载体中。但是我们推荐一次反应不要超过5个插入片段,以保证插入片段正确组装产生阳性克隆。 若多个片段一次反应组装失败,我们建议分成几步组装,降低单次反应的组装片段数量。

当使用12 bp同源序列时,能够得到高效的组装结果,但是这依赖于同源序列的GC含量。我们推荐使用16 bp或更长的同源序列,同源序列的 Tm > 48°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)。

MultiF Seamless Assembly Mix 中的外切酶活性是针对≤100 bp的同源序列长度优化的。

可以。当片段大小≤200 bp时,为了更佳的效果,推荐插入片段使用量为载体的五倍以上。

可以。当组装2-3个片段时,15分钟的反应时间已经足够。当组装4-6个片段时,推荐60分钟的反应时间。通常情况下不推荐反应时间小于15分钟。在某些情况下,更长的反应时间可能适当的提高组装效率,但是不能超过4小时。切勿使用 MultiF Seamless Assembly反应过夜。

在50°C反应时最佳,但是在40-50°C也能工作。

不可以,在His-tag重复密码子后,必须加上与His-tag重复密码子不同的至少3个碱基,并且在同源序列末端要避免重复序列。

两者最主要的区别在于两个相邻片段间的同源序列的长度和组装反应的孵育时间。带15–25 nt 同源序列的 2-3个片段组装,我们推荐用15分钟的反应时间。带20–80 nt 同源序列的大于6个片段组装,我们推荐60分钟的反应时间。4-6个片段所需的DNA总量也要高于2–3个片段。

可以。组装好的产物是完整的序列,可以用做后续的PCR扩增。若最终的产物是个闭合的环形DNA分子,那么MultiF Seamless Assembly产物也可以作为rolling-circle amplification (RCA)的模板。

可以。但是要优化好每条寡核苷酸加入的量。我们推荐每条寡核苷酸起始使用浓度为45 nM。

文献引用 (3)

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