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ABScript II cDNA First-Strand Synthesis Kit (RK20400)

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货号: RK20400
促销价：   ￥210
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产品信息

产品描述
ABScript II cDNA First Strand Synthesis Kit 包含 ABScript II Enzyme Mix 和 ABScript II Reaction Mix 两种经过优化的Mix。其中 ABScript II Enzyme Mix 包含了 ABScript II 逆转录酶和 RNase 抑制剂，而 ABScript II Reaction Mix 含有优化的反应 Buffer。 ABScript II 逆转录酶是一种重组 M-MuLV 逆转录酶，拥有较低的 RNase H 活性同时兼具增强的热稳定性。与野生型 M-MuLV 相比，重组 M-MuLV 逆转录酶可以在更高的温度下合成第一链 cDNA。该酶在高达 48℃时仍具有活性，特异性 cDNA 产量更高。 该试剂盒提供两种逆转录引物。Oligo-dT 引物[d(T)23VN]迫使引物退火至 Poly(A)尾的起始处。优化的 Random Primer Mix特异性较低，因此所有 RNA，包括 mRNA、rRNA、tRNA 均可作为逆转录模板。本试剂盒可合成长达 10 kb 的 cDNA。
产品特点
  • 较低的RNase H活性利于长片段cDNA合成，可以合成长达10 kb的cDNA；
  • 酶最适温度是42℃并且在48℃时仍具有较高的活性；
  • 比普通M-MLV反转录酶（37℃）特异性cDNA产量更高；
  • 适合新冠病毒检测；
  • 配套多种RT引物，mRNA和ncRNA均能作为逆转录模板；
产品组分
试剂盒组成50 RXN
(20 μL / RXN)		100 RXN
(20 μL / RXN)
ABScript II Enzyme Mix (10X)100 µL200 µL
ABScript II Reaction Mix (2X)600 µL1.25 mL
Oligo d(T)23VN （50 μM）100 µL200 µL
Random Primer Mix (60 μM)100 µL200 µL
dNTPs (10 mM each)50 µL100 µL
Nuclease-free H2O1.25 mL1.25 mL

FAQs

Q1：逆转录时，20 μL体系中RNA模板一般使用多少？加入的RNA量越多效果越好吗？

在20 μL逆转录体系中加入的总RNA模板控制在1 ng-1 μg和poly(A)-RNA控制在50 pg-100 ng时，逆转录效果最好。

逆转录体系中加入的RNA模板量也不是越多越好，需要控制在一定的范围内，当模板量过多时会抑制逆转录反应。

逆转录酶的适宜反应温度都是42°C，在42-48°C均有活性。但是对于某些GC含量高的基因或二级结构复杂的基因，在42°C不足以打开二级结构，使cDNA合成无法顺利进行，此时需要在高温65°C条件下使RNA模板/引物变性5 min以获得较好的结果。

ABclonal逆转录产品推荐的反应体系均是20 μL。

其他竞品的逆应体系基本也是20 μL。

客户可以按等比放大或缩小反应体系，但反应体系控制在10-50 μL，否则会影响逆转录效果。

现在市面上的RNA提取试剂盒中都含有基因组DNA去除步骤，所以逆转录产品一般可以不去基因组。如果考虑基因组DNA的污染，可以在qPCR的引物设计时跨内含子。如果引物设计未跨内含子，同时提取的RNA中有基因组DNA残留，此时需要在逆转录产品中需要增加去基因组DNA模块。

去基因组后效果不一定更好，如果DNase I降解DNA产生大量的寡核苷酸片段，可以作为qPCR反应的模板，会产生一些非特异性扩增。

RNase H高活性能够催化降解RNA/DNA杂交体中的RNA。RNase H低活性减少了第一链cDNA合成反应中RNA/DNA杂交体中模板RNA被降解，从而保证第一链cDNA的合成量和长度。

在逆转录反应前一定要电泳验证RNA的完整性，确认RNA没有降解。RNA模板不要保存时间太长，尽快进行逆转录及PCR操作。

通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性；RNA的A260/A280比值大于1.7；乙醇沉淀，然后70％乙醇洗涤可以除去大多数污染物，例如EDTA和胍类；用氯化锂沉淀可以去除多糖；苯酚/氯仿提取和乙醇提取可以去除蛋白污染，如蛋白酶；一些靶RNA可能包含RT的强终止序列; 建议使用随机引物而不是d(T)23VN；使用足量的RNA。

从cDNA进行基因克隆时，突变有可能发生在逆转录过程，也可能发生在PCR过程中。一般用高保真DNA聚合酶（如：KFX DNA聚合酶）进行扩增，控制较低的循环数；也可通过减少模板量、减少循环数降低突变几率。

RNA被降解：分离无污染、高质量的RNA；提取RNA的材料要尽量新鲜，RNA的A260/A280比值大于1.7。防止RNA降解，逆转录反应前，通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。RNA提取后，应保存在100%甲酰胺中。如果使用RNase抑制剂，逆转录温度应低于45°C，反应体系中pH低于8.0，否则抑制剂会释放所结合的RNase，而且，RNase抑制剂必须在0.8 mM DTT存在时才有活性。

RNA中包含逆转录反应的抑制剂：逆转录抑制剂包括SDS、EDTA、甘油、焦磷酸鈉、亚精胺、甲酰胺和肌盐等，将对照RNA和样品混合，进行产量比较，以检验是否有抑制剂。然后70％乙醇洗涤可以除去大多数污染物，例如EDTA和胍类；用氯化锂沉淀可以去除多糖；苯酚/氯仿提取和乙醇提取可以去除蛋白污染，如蛋白酶。

用于合成cDNA第一链合成的引物的退火不充分：确定逆转录温度适合实验所用的引物。对于随机引物，建议在反应温度前先在25°C处理10 min，对于基因特异性引物，可以试一下其他特异性引物或换用Oligo(dT)或随机引物。

起始RNA量较少：使用足量的RNA 模板。

一些靶RNA可能包含逆转录的强终止序列：建议使用随机引物而不是d(T)23VN。

目的序列在分析的组织中不表达：尝试其他组织。

PCR反应失败：对两步法q-PCR，cDNA模板不能超过反应体积的1/5。

引物和模板的非特异性退火：避免引物3΄端含有2到3个dG或dC。在第一链合成中使用基因特异性引物，而不是随机引物或Oligo(dT)。以逆转录的cDNA在qPCR中为模板，开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的遇火温度。使用热启动Taq DNA酶进行PCR，提高反应的特异性。

基因特异性引物设计较差：基因特异性引物设计与普通扩增引物设计采用相同的原则。

RNA中有基因组DNA的污染：使用扩增级(无宿主基因组残留)DNase I处理RNA，设置无逆转录酶对照实验检测基因组DNA污染。

形成引物二聚体：设计在3端没有互补序列的引物。

Mg2+浓度太高：对于每种模板和引物的组合，优化不同的镁离子浓度。

外源DNA气溶胶污染：使用带滤芯的枪头和UDG酶。

cDNA产物的含量过高：PCR反应体系中减少cDNA的加入量。

PCR反应中引物过多：减少引物的用量。

循环数过多：优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数。

退火温度过低：提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸。

DNase I降解DNA使产生的寡核苷酸片段作为模板产生的非特异性扩增：提取高质量RNA，防止被DNA污染（尽量提取无基因组残留的RNA）。

qPCR是将RNA先逆转录为cDNA，然后以cDNA作为模板进行靶标片段扩增。

用于逆转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物，Oligo(dT)及基因特异引物的一种。对于短的不具有发卡结构的真核續胞mRNA三种引物都可。

随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA或一些含逆转录的强终止序列的靶RNA，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的逆转录。主要用于单一模板的逆转录反应。

Oligo(dT)引物：适用于具有polyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA，真核生物的rRNA和tRNA不具有polyA尾巴。）由于Oligo(dT)要结合到polyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

基因特异引物：能与模板序列互补，适用于目的序列已知的逆转录。

内参法：理论上，逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段，所以电泳条带应该均匀分布在泳道上，如果RNA丰度低，电泳检测也可能无产物，这种情况通过PCR扩增内参基因，如果有扩增产物，cDNA的质量基本上可以保证(少数情况下：如目的基因片段过长，可能会有例外)。

已知基因扩增法：如果有已知以此模板扩出来的基因，可以用此基因的引物验证。能扩增出内参，不一定就说明cDNA没有问题。因为内参在cDNA中丰度高，很容易扩出。如果cDNA因为各种原因导致部分降解，从几率的角度讲，就会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果，而内参因为依然是高丰度，扩增很可能不受影响。

RNA部分降解，检测提取RNA的完整性及纯度

不同物种的RNA情况可能不一样，但一般提取成功的总RNA在凝胶电泳中应包含两条清晰的28S和18S rRNA条带，并且前者条带的亮度应是后者的2倍，出现5S带代表RNA发生了降解，其亮度与降解程度成正比。内参基因扩增效果好并不能说明RNA质量优异，因为内参的表达量大，只要是RNA降解的不严重都可以有较好的扩增。分光光度计测的纯RNA的A260/A280的比值应控制在1.9-2.1，提取的RNA有少量蛋白污染会使比值降低，但只要A260/A280的比值大于1.7就不会影响逆转录，最重要的是RNA的完整性。

RNA是否降解严重以及逆转录是否成功：一般情况下，内参基因无扩增很大部分原因是RNA模板严重降解，另一个可能是逆转录失败。虽然内参不能作为判断cDNA质量的标准，但在使用高质量RNA模板的情况下却可以作为逆转录是否成功的标准。

扩增内参基因的引物是否可靠以及PCR所用的试剂有无问题。

一步法RT-PCR即逆转录与PCR扩增在同一个体系内完成。这有助于减少污染几率。由于得到的所有cDNA样品都用来扩增，所以灵敬度更高，最低可以使用0.01 pg的总RNA。成功的一步法RT-PCR,一般使用基因特异性引物起始cDNA合成。

两步法RT-PCR即逆转录和PCR扩增分两步进行，首先进行RNA逆转录得到cDNA，然后以cDNA为模板进行qPCR反应，两步法可以使用Oligo(dT)或随机引物进行cDNA合成，可以从一个特定的样品中逆转出所有mRNA的信息。

总的来说，一步法更方便，可适用于大量样品分析或定量PCR。两步法在选择聚合酶和引物时具有更大的灵活性，但需要注意的是，一步法中由于逆转录与PCR反应在同一反应体系中进行，使用同一反应Buffer两者反应条件不能进行同时优化，且逆转录步骤在一些PCR反应Buffer中效率很低，因此一般不推荐使用。

目的建议
逆转录与PCR使用不同的引物两步法RT-PCR
高灵敏一步法RT-PCR
高特异性高特异性两步法RT-PCR
高保真度高保真度两步法RT-PCR
长的逆转录产物长片段扩增的两步法RT-PCR

文献引用 (116)

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