注意：涉及主要人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集主要人体组织材料之前，必须获得所有受试者的知情同意。

• 1原代组织样本应在离体5 min内放入装有预冷的组织保存液（2-8 ℃）的样本管中，样本被组织保存液完全覆盖，低温（2~8 ℃）48 h内运输转移至实验室。
  注：样本保存管使用泡沫与低温冰袋隔开，防止组织结冰损坏。
• 2实验前先将基质胶埋入冰上解冻4~6 h，同时取出培养基放置室温平衡15 min。
  注：与细胞接触的离心管、试管或者枪头需要用润洗液润洗后使用。
• 3在洁净工作台中，将样本转移至培养皿中，评估获得的组织是否完全由上皮组成。使用灭菌的手术剪刀或手术刀和镊子去除脂肪和肌肉组织，以及组织表面坏死、纤维化或凝结血块杂质。
• 4转移到新的15 mL离心管，加入5~8 mL DPBS，使用涡旋仪震荡3~6 s，去除干净清洗液，重复3~5次，注意消化道组织（如胃、肠组织等）应增加清洗次数2~3次，至清洗液澄清。
  注：每次清洗后的上清液应去除干净，避免污染源残留
• 5使用镊子将组织转移至1.5 mL离心管中，加入200 μL组织消化液，用灭菌的剪刀将组织剪碎为0.5~2 mm²大小。
  注：组织剪碎大小，吸取后不堵1 mL枪头为佳；如组织过大，可选取质地较好的部分，剪碎用时应控制在10 min以内。也可选择刀柄+一次行刀片进行组织切碎处理。

• 1待类器官培养到直径为100~500 μm大小时（或变黑不再增大时），即可进行类器官的传代（每代约3~10天）。以下操作与细胞接触的耗材均需用润洗液润洗后使用。
• 2吸弃旧培养基，加入适量类器官消化液（每50 μL胶滴使用500 μL），吹打重悬基质胶，在原孔板中进行消化，37 ℃ 5~10 min后，取出使用润洗的枪头吹打5~10次，镜下观察，类器官解离成簇状细胞团（5~30个细胞成团为佳），消化不充分可适当延长消化时间或吹打次数，加入2倍以上消化液体积的DPBS终止消化，转移至润洗过的15 mL离心管中，4 ℃ 300 g离心5 min。
  注：类器官消化液室温下仍具备解离效果（约为37℃条件下50%消化效果），请注意加入类器官消化液后 室温操作或37℃消化总时间控制在20 min以内，一定避免将类器官过度消化为单细胞。类器官形态和数量不同，类器官消化时间和吹打次数也需要适当调整。
• 3吸弃上清液，DPBS清洗，转移至润洗过的1.5 mL离心管，4 ℃ 300 g离心5 min，去除残留的消化液，并使用DPBS清洗。
• 4清洗完成后将离心沉淀中的细胞进行传代培养，在细胞沉淀中加入基质胶（>70%）并在冰上混匀（注意，混匀吹打的动作要轻柔，切忌产生大量气泡，常温混匀则需要控制在15 s内），混匀后置于冰上。
  注：基质胶稀释比例应在70%以上以保证培养过程中基质胶的结构稳定性。
• 5将基质胶和细胞的混合悬液点入培养孔板底部正中央，形成胶滴，注意避免悬液接触孔板侧壁。（推荐：96孔板接种3~10 μL/孔，48孔板接种10~20 μL/孔，24孔板接种30~50 μL/孔）。
  注：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。接种密度按照基质胶体积，传代比例一般为1:2~1:4；如遇类器官数量少，应适当降低传代比例至1:0.5或1:1，在重悬基质胶后，可以首先接种10 μL显微镜下观察接种密度，如密度过高，可补加基质胶适当调整；接种密度如下图参考密度所示。
• 6将培养板放入37℃和5% CO₂的培养箱中20-30 min，让基质胶凝固。
• 7待基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入室温平衡的类器官完全培养基，避免破坏已凝固结构。（推荐：96孔板加入100 μL/孔，48孔板加入250 μL/孔，24孔板加入500 μL/孔）。
  注：不要将培养基直接添加到基质胶液滴的顶部，因为这可能会破坏已凝固结构。
• 8将培养板置于37 ℃和5% CO₂的恒温培养箱中。
• 9每隔2~3天更换一次培养基，小心地从孔中吸出培养基，并加入新鲜的室温平衡的类器官完全培养基。
  注：如遇培养基变黄应立即更换，换液周期最多不可超过4天。
• 10密切监测类器官生长状态，直到类器官需要进行下一步实验。

• 1在镜下观察24孔板中的类器官，选取直径大于100 μm、形态饱满、边缘清晰、增殖旺盛的孔进行冻存。避免选取出现大量碎片、中心发黑的类器官。
• 2吸弃旧培养基，向每孔中加入500 μL预冷的DPBS，轻轻晃动培养板，然后吸弃。
• 3向每孔中加入500 μL的类器官消化液，1 mL枪头轻柔地吹打5–10次，在孔板中37 °C孵育5–10 min。再次使用1 mL枪头吹打5-10次，镜下观察到细胞团后，加2倍体积（1 mL）DPBS终止消化。
• 4收集孔中所有液体，4 °C下，1000 g离心5 min，弃上清液，注意不要触及管底的细胞团沉淀。用预冷的DPBS重新重悬再洗一次。
• 5向沉淀中加入少量预冷的DPBS轻柔吹打，使细胞团重悬成均匀的悬液。计数后按照3–5×10⁵细胞/支或传代前状态良好类器官3–6个50 µL胶滴/支分装至冻存管。
• 6向每支已装有类器官悬液的冻存管中缓慢滴加0.5–1 mL的类器官冻存液，置程序降温盒中，–80 °C过夜后转入液氮冻存。

• 1水浴锅37 °C预热、离心机4 °C预冷、基质胶插入碎冰中4 °C解冻、DPBS 4 °C预冷、培养基平衡到室温，从液氮中取出结直肠癌类器官冻存管，立即投入37 °C水浴锅中，轻轻晃动至仅剩米粒大小冰晶（整个过程≤90 s）。
• 2从水浴中取出冻存管，用75%乙醇棉球彻底擦拭管外壁后移入超净台。吸出全部细胞悬液到预先用润洗液润洗的15 mL离心管中，缓慢加入10 mL DPBS培养基，4 °C 250 g 离心5 min，弃上清。
• 3向细胞沉淀中加入1 mL预冷的DPBS，用200 μL枪头轻轻吹打（避免产生气泡）重悬细胞，取样计数后在4 °C下，250 g离心5 min，弃上清。
• 4重悬按照2-5×10⁴/50 µL胶滴或参考冻存前的胶滴数量，按照体积比1:1或1:2，在冰上使用基质胶轻柔重悬，避免气泡。
  注：为防止基质胶室温凝固，此步骤应尽快完成。
• 5接种24孔板每孔的中央位置滴一滴（50 μL）结直肠癌类器官-基质胶混合物，迅速放入37 °C、5% CO₂培养箱中，孵育20-30 min等待基质胶完全凝固，沿着孔壁缓慢地加入500 μL结直肠癌培养基。
• 6培养37 °C、5% CO₂培养箱中静置培养，24 h后镜检并换液，后续按常规传代培养。